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马病毒性动脉炎检疫技术规范

SN/T1142—2011

5病毒分离鉴定

5.1仪器设备

超净工作台或生物安全柜、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、液氮贮存罐，蔡氏滤器和微孔滤膜(0.22ym)、高压灭菌钢、离心机、超声波破碎仪、微量细胞培养板(96孔)、微型振荡器、微量可调移液器

(200pL)、电子天平、细胞瓶和吸管(1mL,2mL,5mL,10mL)等。

5.2试剂与材料

MEM培养基、抗生素贮存液、细胞消化液、细胞培养皱和细胞维持液，1%细胞染色液，7.5%羧甲基纤维素、红细胞裂解液、磷酸盐缓冲液(PBS)、兔肾细胞(RK-13)、马病毒性动脉炎病毒(EAV)标准病毒株(Bucyrus株)和各种常规试剂等，试剂配制见附录A。

5.3样品采集与处理

5.3.1样品采集与运送

无菌采集动物抗凝全血(不宜用肝素作抗凝剂),死胎或活产马驹的脑、心、肺、肝、肾、脾和淋巴结等组织，公马可采集精液。采集的样品应立即放入冰盒中，尽快运送到实验室。如果不能及时送往实验室，组织样品冷冻于-20℃以下保存(抗凝全血样品4℃保存)。

5.3.2样品处理

5.3.2.1全血样品的处理：取抗凝血加入2倍～3倍体积红细胞裂解液，混匀静止4min~5min,待红细胞完全破碎，1500r/min离心5min,弃上清液除去破碎的红细胞，得到白细胞沉淀(若仍有红细胞，则重复上述步骤，直到红细胞除尽),加入PBS缓冲液，制成白细胞悬液，反复冻融两次，低温(-20℃)

保存备用。

5.3.2.2动物组织样品的处理；无菌处理样品，样品称量，置于无菌容器内，加入少量维持液，用灭菌研槌研磨，制备成组织悬液。再加培养液，制成终浓度为10%的组织悬液。以2000r/min离心10min,收取上清液低温(-20℃)保存备用。

5.3.2.3动物精液的处理：将料液超声波裂解三次(300w),每次15s;然后在4℃下2000r/min离心10min,沉淀精子细胞，取上清液低温(-20℃)保存备用。

5.4病毒分离

5.4.1将上述上清液或细胞悬液用维持液作倍比稀释，无菌接种于已长成单层的RK-13组胞瓶或细胞培养板上，每个滴度接种两瓶或两孔。同时设立细胞对照和阳性对照，单层细胞仅加维持液作细胞对照，用60倍稀释的标准病毒接种作阳性对照。

5.4.2加盖摇匀使之均匀分布于整个细胞层，置于5%二氧化碳路养箱中37℃吸附1h。

5.4.3加入含0.75%羧甲基纤维素的培养液，置于5%二氧化碳培养箱中37℃维续培养，每日在显微镜下观察细胞病变(CPE)情况(细胞圆缩、脱离、裂解)。

5.4.4如果不出现CPE,应盲传2代～3代，即将细胞培养物冻融两次，再接种到单层细胞培养5d~

7d后，用细胞染色液(工作液为0.1%福尔马林缓冲结品紫溶液)染色。观察细胞单层是否细胞壁不完整的死细胞区域。

5.5结果判定

检查各种对照试验，细胞对照正常，无CPE;阳性对照出现明显的CPE,说明试验成立。如果试验

SN/T1142—2011

组出现明显的CPE,表现为细胞圆缩、脱落、裂解，则判为病毒分离阳性：如果没有明显的CPE,结晶紫染色后，细胞单层出现细胞酸不完整的死细胞区域，也判为病毒分离阳性。

5.6病毒鉴定

用微量血清中和试验和荧光RT-PCR方法对分离的病毒进行鉴定。

6微量血清中和试验

6.1仪器设备

生物安全柜、二氧化碳培养箱、例置显微镜、液氮贮存罐、高压灭菌锅、微量细胞培养板、微型振荡器，吸管(1mL,2mL,5mL,10mL)等。

6.2试剂与材料

细胞培养液、细胞维持液、细胞消化液和抗生素贮存液等(试剂配制见附录A),标准阳性血清，阴性血清和被检血清经灭活备用(马血清56℃灭活30min,驴、骤血清60℃灭活30min,RK-13细胞和马病毒性动脉炎病毒(EAV)Bucyrus株或其他参考毒株。

6.3操作方法

6.3.1中和病毒滴废(TCID)测定

6.3.1.1中和病毒制备：将保存于液氮中的标准种毒EAVBucyrus株取出置于4℃缓慢融化，将融化的种毒用维持液作60倍稀释后，取1mL接种于长成单层RK-13细胞的细胞瓶中，37℃吸附1h。然后，先用维持液洗涤一次，再加入维持液，放置于37℃愠温箱中培养36h~48h,当5