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番茄的遗传转化

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摘要：本研究以小型番茄为试材,建立其以子叶、下胚轴为外植体的高效、稳定

再生体系及遗传转化体系。子叶外植体与农杆菌共培养后,经过诱导,根的再生，

初步建立了农杆菌介导的遗传转化体系。是目前最有效的途径之一。农杆菌对植

物释放的化学物产生趋化反应，向植物受伤组织集中。经共培养后，受伤部位的

化学诱导物透过农杆菌的细胞膜使Ti质粒上的Vir基因活化。Vir基因产物使Ti

质粒上的T—DNA进入植物细胞，并整合到植物核基因组中。插入在T—DNA

左右边界区内的目的基因也随之整合到植物染色体上，从而使目的基因在植物细

胞中得到表达。近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物中也得到了广泛应用。

关键字：番茄下胚轴子叶转化

一、实验材料、试剂和仪器设备

1.实验材料：番茄种子

2.试剂：大量元素、氯化钙、微量元素、铁盐、有机成分、琼脂、蔗糖、蒸馏水、

1mol∕LNaOH、6BA、NAA、升汞、蛋白胨、酵母粉、卡那霉素、75％乙醇

3.仪器设备：天平、烧杯、量筒、移液管、药勺、称量纸、玻璃棒、吸耳球、PH

试纸、培养瓶、封口膜、橡皮筋、高压灭菌锅、电炉、标签纸、记号笔、滤纸、

镊子、剪子、移液枪、枪头、酒精灯、培养皿

二、实验步骤

1.外植体的制备

(1)MS培养基母液的配制

按以下的成分与浓缩比例配制母液

大量元素50mg∕L

氯化钙50mg∕L

微量元素1mg∕L

有机成分1mg∕L

蔗糖30g∕L

琼脂6g∕L

(2)MS培养基的配置

配制200ml的MS培养基，将所需要的试剂混合后加热溶解，用1mol∕LNaOH

调节PH至5.8，宁大勿小偏酸不凝固，然后分装到灭好菌的培养瓶中。

(3)高压灭菌

将配制好的培养基、培养瓶、无菌水、有滤纸的培养皿灭菌

(4)铺种子

打开超净工作台紫外灯照射约30min，然后关闭紫外灯，打开超净工作台的风机。

先数好所需要的种子，放在一个小烧杯中，到入升汞，没过种子，五到六分钟。

然后回收升汞，把无菌水倒入摇晃，用灭菌好的无菌水洗3—4次，拿镊子灭菌，

要灭透。将种子放在灭好菌的有滤纸的培养皿中，吸干水。拿灭好菌冷却的镊子

将种子接进灭好菌的8瓶培养基中，每瓶5—6粒，接完种子将培养基放在培养

室中培养，发育一周左右。

结果：共培养12瓶种子，每瓶接种5颗种子，平均每瓶生长了4颗，萌发率为

48∕60=80％。

2.工程菌的活化

(1)LB培养基的制备

根据以下配方，分别配制LB固体、液体培养基，分装后高压灭菌。

液体培养基用量：蛋白胨10g∕L酵母粉5g∕L氯化钠10g∕L

固体培养基用量：蛋白胨10g∕L酵母粉5g∕L氯化钠10g∕L琼脂10g∕L

(2)倒平板

灭菌后的LB固体培养基冷却至40℃左右，加入卡那霉素，摇匀后倒入已灭菌培

养皿中，冷却备用。

(3)划线

用已灭菌的接种环从保存的原菌液取一环，在已冷却的平板上划线。封好培养皿

置于28℃培养箱中培养2天。

(4)摇菌

从平板上挑取单菌落，接种到20ml附加卡那霉素的细菌培养液体培养基LB中，

在恒温摇床上，于28℃，180r∕min培养至OD600为0.4—0.6，取此时菌液，按

1％—2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相

同的条件下培养6小时左右，OD600为0.4—0.6时即可用于转化。

3.农杆菌接到的遗传转化

(1)预培养

将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm的小块，无菌胚轴、茎切成约0.8—1cm长的切段，

接种在8瓶愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下：预

培养2—3天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。

结果：共培养16瓶，均没有染菌。

(2)侵染

将凝了的MS培养基加热至成液体（200ml），放在超净工作台上，冷却至40℃

时，加入100ul卡那霉素和100ul头孢摇匀，均匀且迅速倒入已灭菌好的8个培

养瓶中，待其凝固，将直接侵染与预培养的子叶和下胚轴分别移到培养基中。

(3)共培养

将侵染过的外植体接种在愈伤组织诱导或分化培养基上，在28℃按培养条件下

共培养2—4天。

结果：共培养16瓶其中有3瓶污染，原因可能是①操作中带入细菌②用镊子夹

的太紧了③农杆菌侵染时间过长。

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