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ICS11.220

B41

中华人民共和国农业行业标准

NY/T684—2003

犬瘟热诊断技术

Diagnostictechniquesforcaninedistemper

2003-07-30发布

2003-10-01实施

中华人民共和国农业部发布

I

NY/T684—2003

前言

本标准的附录A为规范性附录。

本标准由农业部畜牧兽医局提出并归口。

本标准起草单位：农业部兽医诊断中心。

本标准主要起草人：田克恭、王宏伟、遇秀玲、陈西钊、王传彬。

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NY/T684—2003

犬瘟热诊断技术

1范围

本标准规定了犬瘟热(CD)的临床诊断、犬瘟热病毒(CDV)的分离与鉴定、免疫酶试验和免疫酶组

织化学方法等诊断技术。

本标准适用于犬瘟热的诊断。

2临床诊断要点

2.1临床症状

CD的临床表现多种多样，与CDV的毒力，环境条件，宿主的年龄、品种及免疫状态有关。病犬体温升高至40℃以上，鼻流清涕至脓性鼻汁，脓性眼屎，有咳嗽、呼吸急促等肺炎症状，腹下可见米粒大丘疹。病程长的犬足枕角质层增生。病后期CDV侵害大脑时则出现神经症状，头、颈、四肢抽搐。

2.2病理变化

CDV为泛嗜性病毒，对上皮细胞有特殊的亲和力，因此病变分布非常广泛。新生幼犬感染CDV通常表现胸腺萎缩。成年犬多表现结膜炎、鼻炎、气管支气管炎和卡他性肠炎。表现神经症状的犬通常可见鼻和脚垫的皮肤角化病。中枢神经系统的大体病变包括脑膜充血，脑室扩张和因脑水肿所致的脑脊

液增加。

CDV的包涵体通常呈嗜酸性，位于胞浆内，直径1μm～5μm,可在粘膜上皮细胞、网状细胞、白细

胞、神经胶质细胞和神经元中发现。核内包涵体多位于被覆上皮细胞、腺上皮细胞和神经节细胞。

3病毒分离与鉴定

3.1材料准备

3.1.1试剂

3.1.1.1改良最低要素营养液(DMEM)培养基，配方见第A.1章。

3.1.1.2非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)。

3.1.1.3标准阳性血清：CDV单克隆抗体，中和抗体效价1:1024。

3.1.1.4标准阴性血清：无CDV感染的犬血清。

3.1.1.5新生牛血清处理：用无血清DMEM洗涤细胞两次，加入培养液二分之一量的新生牛血清，37℃吸附1h。吸附后的新生牛血清分装，置—20℃备用。

3.1.1.6青霉素、链霉素。

3.1.2器材

a)细胞培养瓶；

b)吸管；

c)二氧化碳培养箱；

d)37℃恒温水浴箱；

e)普通冰箱及低温冰箱；

f)离心机及离心管；

g)研磨器械；

h)普通光学显微镜；

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NY/T684—2003

i)微量加样器，容量5μL~50μL,50μL~200μL;

j)0.45μm微孔滤膜。

3.1.3样品

CDV存在于病犬心脏、肺脏、脾脏、胸腺、淋巴结等组织器官中。无菌采集这些器官用无血清DMEM制成20%组织悬液，3000r/min离心30min,取上清。10000r/min离心20min,取上清用于CDV分离。

3.2操作方法

3.2.1细胞培养

用含8%已处理的新生牛血清的DMEM培养基，在37℃培养Vero细胞。每3d～4d传代一次，

细胞长成单层时，用于CDV分离。

3.2.2病料接种

将0.1mL处理好的组织悬液接种Vero细胞，33℃吸附1h,加入无血清DMEM继续培养5d~7d,观察结果。

3.2.3结果观察

CDV感染Vero细胞4d~5d表现为细胞变圆、胞浆内颗粒变性和空泡形成，随后形成巨细胞和合胞体，并在胞浆中出现包涵体。若第一次接种未出现细胞病变，应将细胞培养物冻融后盲传三代。如仍无细胞病变，则判为CDV检测阴性。

3.2.4CDV的鉴定

将出现细胞病变的细胞培养物，按第4章的方法制备细胞涂片，用CDV单克隆抗体进行鉴定。

4免疫酶试验

4.1材料准备

4.1.1试剂

4.1.1.1磷酸盐缓冲液(PBS):配制见第A.2章。

4.1.1.2抗原涂片的制备：将CDV接种Vero细胞，接种后5d～7d,病变达50%～75%时，用胰蛋白酶消化分散感染细胞，PBS洗涤三次后，稀释至1×10°个细胞/mL。取印有10个～40个小孔的