微生物学第八章微生物与基因工程.ppt

③重组子快速搜寻法：（EcoRI-HindⅢ联合酶切→BamHI酶切→PstI酶切）。第64页,共76页，2024年2月25日，星期天⑶PCR鉴定用与插入片段两侧互补序列作为引物，以重组质粒DNA作为模板，进行PCR分析，可快速测出插入DNA片段大小及鉴定其序列特异性。第65页,共76页，2024年2月25日，星期天⑷DNA序列测定为了确证目的基因序列的正确性，必须对重组的DNA进行序列测定。（以便最终获得目的基因的编码序列和基因调控序列，精确界定基因的边界）第66页,共76页，2024年2月25日，星期天a.DNA的化学降解测序法b.DNA的双脱氧末端终止测序法（国际目前常规测序方法）c.其它：如DNA全自动序列分析系统，超薄水平凝胶电泳技术，基因芯片杂交测序，扫描隧穿显微镜测序等等。第67页,共76页，2024年2月25日，星期天注：一般DNA序列测定前，鉴定出期望重组子后，要进行目的基因的定位。如果期望重组子中外源DNA比目的基因长，则目的基因在DNA片段上所处的位置必须确定。以便删除非目的基因的DNA片段，简化目的基因的进一步分析。第68页,共76页，2024年2月25日，星期天3、外源基因表达产物的鉴定如果克隆在受体细胞中的外源基因编码产物是蛋白质，则可通过检测这种蛋白质的生物功能或结构来筛选和鉴定期望重组子。这种方法应用的前提是重组分子必须含有能在受体细胞中发挥功能的表达元件。也就是说外源基因必须表达其编码产物，并且受体细胞不能合成这种蛋白质。第69页,共76页，2024年2月25日，星期天⑴表达产物免疫活性测定（又称放射免疫原位检测法）如果（前提条件）表达产物是一种蛋白或蛋白质的一部分，它具有抗原性可与其特异抗体发生免疫反应。此法操作类似于菌落原位杂交：硝酸纤维素薄膜印膜→处理滤膜裂解菌落释放蛋白→固定处理后与第一抗体反应→洗膜后再与标记的第二抗体反应→检测。第二抗体可以用同位素标记也可以用生物素或酶标记。第70页,共76页，2024年2月25日，星期天⑵表达产物生物活性检查若表达产物是一种酶，可测定其酶活性。若表达产物是一种酶抑制剂，可测定其抑制酶活性能力的大小。第71页,共76页，2024年2月25日，星期天⑶蛋白质凝胶电泳检测法：从重组克隆中分别制备蛋白质粗提液，以非重组子作对照；走蛋白凝胶电泳。新谱带----期望重组子（应剔除载体基因表达的产物）。第72页,共76页，2024年2月25日，星期天⑷表达产物氨基酸序列测定测定表达产物“N”端氨基酸序列。第73页,共76页，2024年2月25日，星期天探针获取的方法：A：目的基因的同源序列B：cDNAC：人工合成一般最佳探针长度范围为100-1000bp，另外探针内部不能含有大面积的互补序列。第74页,共76页，2024年2月25日，星期天3、基因文库与cDNA文库的构建利用重组DNA技术，可将某一原核微生物或真核微生物染色体基因组的全部遗传信息贮存在由重组体群体（如重组噬菌体群体）构成的基因文库（genomiclibrary）或cDNA文库（cDNAlibrary）之中，犹如将文献资料贮存于图书库一样，以供长期贮存和随时调取克隆基因使用。第75页,共76页，2024年2月25日，星期天感谢大家观看第76页,共76页，2024年2月25日，星期天原核生物的大肠杆菌及真核生物的酿酒酵母，由于他们具有生长迅速、极易培养，能在廉价培养基上生长，遗传学和分子生物学背景十分清楚等突出优点，已成为当前被广泛应用的重要克隆载体宿主。另外还有枯草杆菌和昆虫细胞系等。第32页,共76页，2024年2月25日，星期天第二节基因工程的基本过程基因工程操作主要步骤为：①分离或合成基因（切），②通过体外重组将基因插入载体（接），③将重组DNA导入细胞（转），④扩增克隆基因（增），⑤筛选重组体克隆（检），⑥对克隆的基因进行鉴定或测序，⑦控制外源基因的表达，⑧得到基因产物或转基因动物、转基因植物、工程菌（利用基因工程技术获得的具有新功能的微生物称为工程菌）。第33页,共76页，2024年2月25日，星期天第34页,共76页，2024年2月25日，星期天第35页,共76页，2024年2月25日，星期天一、目的基因的分离或合成1，从基因文库中筛选基因文库是指生物染色体基因组各DNA片断的克隆总体（即某一特定生物体全基因组的克隆集合）。人们可以根据目的基因的性质和序列从中筛选。第36页,共76页，2024年2月25日，星期天2，cDNA法目的DNA可用反转录酶以mRNA为模板来合成。（以该蛋白质的单克隆抗体纯化该基因的核糖体，再洗