总提取及免疫组化.ppt

一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，然后4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。免疫组化原理及流程介绍1.防止脱片；2.使抗原抗体结合更稳定。第31页,共49页，2024年2月25日，星期天甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后，放入湿盒中室温1小时，然后4度过夜，冰箱中取出后需37℃复温45min。免疫组化原理及流程介绍具体做法：第32页,共49页，2024年2月25日，星期天免疫组化原理及流程介绍6.二抗孵育二抗:可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标记(如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），作用是检测一抗。第33页,共49页，2024年2月25日，星期天二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。免疫组化原理及流程介绍第34页,共49页，2024年2月25日，星期天1)将一抗倒掉并用PBS洗5min×5次；2)用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入37℃恒温烤箱中30min。3)用PBS洗5次×5min免疫组化原理及流程介绍具体操作：第35页,共49页，2024年2月25日，星期天7.SP反应SP染色法即链霉素抗生物素蛋白生物素过氧化酶连接法。该法是ABC法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合PO基。第36页,共49页，2024年2月25日，星期天免疫组化原理及流程介绍1）加入SP复合液后放入37度烤箱中30min。2）用PBS洗5次×5min。具体操作：SP染色法的特点:灵敏特异性低，成本低。第37页,共49页，2024年2月25日，星期天免疫组化原理及流程介绍8.显色在免疫组化中，由于抗原抗体所形成的复合物本身没有颜色，不能直接观察，只能借助于其他某些化学基团的显色作用，是复合物显色，有利于显微镜下观察。第38页,共49页，2024年2月25日，星期天免疫组化原理及流程介绍通常在过氧化物酶（HRP）法中，显色剂为DAB。DAB(3,3-二氨基联苯胺显色液)配法:DAB50mg0.05MTB100ml30%H2O230-40ulABC法SP法PAP法第39页,共49页，2024年2月25日，星期天免疫组化原理及流程介绍9、复染、脱水、透明、封片复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用的试剂为苏木素。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蓝即可。第40页,共49页，2024年2月25日，星期天1)用PBS3次×3min后，用双蒸水洗5min；加一大滴苏木素染液，（胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染20s），自来水冲洗，双蒸水洗5min，再用PBS返蓝5min。2)脱水：50%ethanol(1-2)min;70%ethanol(1-2)min;95%ethanol（1-2）min；95%ethanol（1-2）min；100%absoluteethanol:(1-2)min；100%absoluteethanol:(1-2)min。3)透明：Xylene1×(1-2)min→Xylene2×(1-2)min4)封片：中性树胶。免疫组化原理及流程介绍第41页,共49页，2024年2月25日，星期天免疫组化原理及流程介绍四免疫组化结果分析免疫组化结果的判断原则：1.必须设对照。2.抗原表达必须在特定部位。3.阴性结果不能视为抗原不表达。第42页,共49页，2024年2月25日，星期天免疫组化原理及流程介绍1．阳性染色特点①Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构性。（非特异性染色细胞与组织无区别）②染色强度不同：颜色深浅不一（非特异性染色弥散性均匀）。★须从以下几个方面综合评价：第43页,共49页，2024年2月25日，星期天2．组织切片制作过程的影响