第7章-亲和层析.pptVIP

第七章亲和层析内容提要第一节 基本原理第二节 操作第三节 提高吸附剂的操作容量第四节 应用实例第一节基本原理一、亲和层析的概念亲和力根据生物体中高分子化合物能与之相对应的专一分子特异识别和可逆结合的特征，将生物分子间的这种结合能力称为亲和力。亲和层析法的实质是在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一般反应性能的间隔臂，随后再连接配体（酶、抗原、激素等）组成固定相,配体高选择地吸附与其有生物特性的大分子而被保留,非特异的分子不被保留先流出层析柱，保留在柱上的分子将以纯品形态洗脱下来。三、亲和层析具备的三要素介质(基质)—具有活化基团间隔臂—连接介质与配体的分子配体—具有识别能力反配体（分离物）—与配体进行可逆结合五、亲和层析的特点条件温和：不影响样品的生物活性，适合生物大分子的操作。纯化效率高：一步法分离和纯化混合物中的样品，提纯达几千倍,得到高纯度样品。选择性强：依据生物学特异性，而非物理化学性质分离原理。故特异的层析图为2个峰，第1个为杂峰，第2峰为纯品。五、亲和层析的特点柱层析柱小Vt＝1～1.5ml。上样量大,达1/2Vt体积并对样品的浓度与纯度要求不高。操作简单，时间快速。柱子填充载体昂贵，配体的特异性，有时找不到适宜的配体，不适合所有生物大分子样品。内容提要第一节 基本原理第二节 操作第三节 提高吸附剂的操作容量第四节 应用实例二、配基（配体）的选择优良的配体必须具备两个条件：配体与生物大分子具有合适的亲和力；配体具有与载体牢固地结合，又不影响与生物大分子之间的亲和力。三、亲和吸附剂的制备载体的活化（CNBr）配体的偶联结合能力的测定四、特异性吸附欲分离物质与亲和吸附剂结合，当结合力较强时，配体与有效成分紧密结合，随着样品的加入，亲和成分恒定增加并不断地吸附上柱，形成致密的复合物带，使吸附容量增至最大，达到饱和。影响吸附容量除亲和力外和还与pH、离子强度有关。五、层析步骤样品制备结合步骤装柱操作流速控制洗脱方法淋洗洗脱目标样品柱子再生洗脱方法B.非特异性洗脱：通过改变洗脱液的条件（pH、离子强度、温度℃和介电常数），即能改变蛋白质的构象，降低蛋白质与配体的亲和力、不损害蛋白质与吸附剂的稳定性。内容提要第一节 基本原理第二节 操作第三节 提高吸附剂的操作容量第四节 应用实例第三节提高吸附剂的操作容量间隔臂:不同长度的间隔臂（B＝1nm），(C=2.1nm)对靶酶的亲和力的差异。三、减少结合键增加配体与蛋白质的互补效应以蛋白质与多肽为配体时，以最少的共价键连接至载体，利于保护蛋白质的高级结构及生物活性；控制偶联反应的pH，减少蛋白质分子与基质连接的键；位点的减少，可以结合更多的蛋白质，提高结合容量。四、残留活化基团的封闭封闭多余的活化基团，避免非特异性吸附。内容提要第一节 基本原理第二节 操作第三节 提高吸附剂的操作容量第四节 应用实例第四节应用亲和层析的基础是对蛋白质进行选择性的吸附－脱附，一般的结果是层析图谱上出现二个层析峰，不保留峰与脱附峰，脱附动力学一般较慢，脱附的层析峰宽而拖尾。亲和层析应用一、纯化特异性生物分子1.纯化抗原、抗体及其结合物；2.分离糖蛋白、各种凝集素；3.含巯基蛋白质的分离；4.用寡聚核苷酸分离核酸；5.凝集素配体结合膜蛋白的分离技术。2.纯化糖类分子配体为外源凝集素的Sepharose6B的亲和层析介质，特异地结合碳水化合物的糖类残基或糖化细胞膜组分、细胞、亚细胞结构及糖蛋白等。凝集素和糖蛋白的亲和层析分离凝集素是在自然界广泛存在的一大类糖结合蛋白。它们具有不同的糖结合专一性。利用天然存在的一些多糖和被固定化的不同糖链结构的糖蛋白，可以有效地分离纯化不同型的凝集素，也可应用固定化的凝集素分离纯化各种糖蛋白。不同的糖蛋白具有不同的单相组分和糖链结构，它们和不同的凝集素呈现出不同的结合能力。常用的凝集素：ConA、LCA对甘露糖专一WGA对N-乙酰氨基葡萄糖专一5.受体蛋白的纯化由于受体蛋白在激素与其互补的膜结合中的重要作用，同时其含量极低，使研究受阻。利用亲和层析法分离受体蛋白成为可能。例：胰岛素受体蛋白的纯化：将胰岛素偶联到溴化氰活化的琼脂糖凝胶，结合受体蛋白，特异性洗脱，释放出目标蛋白质。6.重组蛋白用基因工程的方法引入特殊结合位点（如金属结合位点），将其加在重组目的蛋白的氨基端或羧基端。紧邻结合位点的位置加入