转基因动物生物反应器的基因构建与表达.pdf

摘要近年来，生物学和分子生物学研究领域的成就促进了转基因

动物生物反应器的蓬勃发展。用转基因动物生物反应器生产药用蛋白

是生物技术领域里的又一次革命，它以一个全新生产珍贵药用蛋白的

模式区别于传统药物的生产。本文着重介绍转基因动物生物反应器的

基因构建以及转基因动物组织特异性表达的最新进展。

以合理的费用获取大量在人体内原本稀少的血浆蛋白在不久前还

只是幻想。然而，近年来生物学和分子生物学取得的显著进展终于使

这种幻想成为现实。其中，将外源DVA用显微技术注入生殖细胞的

原核，将重组DVA转入小鼠胚胎细胞和将DVA整合入宿主染色体和

种系传递等重要发现，使用转基因（Tg）动物生产药用蛋白成为可能。

此外，生物学技术的发展，如对卵细胞的获得、操作以及再植入和重

组DNA等技术进步都为转基因动物生物反应器的成功提供了保证。

转基因动物生物反应器生产药用蛋白一般有两种技术路线。第一

种是将目的基因在同源组织中表达蛋白质；第二种是将目的基因构建

成杂合基因，转入动物胚胎，通过转基因动物的分泌器官收集并提纯

药用蛋白。转基因动物分泌的蛋白经过后加工酷如人体天然蛋白的结

构，也有完全相似的生物活性。

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同源组织中表达蛋白质

目前，在同源组织中表达蛋白质最典型的例子是在动物的红细胞

中表达人的血红蛋白。在人的血红蛋白基因编码序列里启动子有2个

CACCC盒，而对应的猪的启动子里只有一个，另一个靠近它的是

CGCCC盒。Sharma等[1]将猪的β-启动子与人的β编码基因融合，并将

人的β-基因座调控区（β-LCR）和α、ε基因与融合基因的β基因连接在

一起构成载体，转入猪胚胎细胞，从转基因猪分泌乳汁中得到的重组

人血红蛋白含量高达32g/L。

在转基因动物的分泌器官中生产蛋白

转基因动物表达重组蛋白多以乳腺、唾液腺和膀胱为靶位。在这

些表达器官中，通过构建合适的载体，选择适当的启动子和调控序列

可产生比正常水平高得多的重组蛋白。不过，生产系统应尽可能与循

环系统隔离，以减少表达产物对宿主动物的影响。

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乳腺生物反应器

将所需目的基因构建入载体，加上适当的调控序列，转入动物胚

胎细胞，使转基因动物分泌的乳汁中含有所需要药用蛋白。从融合基

因转入胚胎细胞到收集蛋白质有一个过程，包括胚胎植入、分娩和转

基因动物的生长。转基因动物从出生到第一次泌乳，猪、羊、牛各需

12、14、16个月；并且只有雌性动物泌乳且不连续，一般可持续2、6、

10个月。牛、羊等大型家畜能对药用蛋白进行正确的后加工，使之具

有较高的生物活性，同时产奶量大，易于大规模生产，因而成为乳腺

生物反应器理想的动物类型。

抗凝血酶Ⅲ第一个进入临床试验的转基因蛋白产物是抗凝血酶

Ⅲ，将半乳糖β-酪蛋白的启动子和含抗凝血酶Ⅲ基因序列相连，转入

绵羊胚胎细胞，在转基因绵羊的乳液中得到有生物活性的蛋白产量可

达7g/L[2]。目前该蛋白正用于冠状动脉旁路手术患者的二期临床验

证。

β-乳球蛋白在实验过程中人们发现牛的β-乳球蛋白（BLG）基因

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并能在乳腺中特异性表达。Hyttinen等[3]将含有5＇端2.8kb

和3＇端1.9kb的牛BLG基因片段构建成载体，转入小鼠胚胎细胞，

可在转基因小鼠的乳腺中特异表达高水平的BLG，此外，还发现CpG

位点的甲基化程度与BLG的表达量有关，甲基化少的转基因小鼠乳液

中BLG分泌量较大，可达1～2mg/ml，而其他转基因小鼠分泌量小于

0.1mg/ml。

红细胞生成素（EPO）目前国内外均采用CHO细胞表达生产人

EPO，成本比较昂贵，而用转基因动物生产的EPO，可能是一条理想

的途径。将EPOdNA分别以HindⅢ和BamHI酶切，1%琼脂糖凝胶

电泳回收5.4kb的HinⅢ/BamHI片段，插入pGEM-7zf(+)载体，再将

867bp的BLG启动子插入EPO基因之前EcoR、ClaI位点，构建表达

载体pGEM-3zf(+)β-LG-EPO。通过显微注射