免疫荧光实验的实验操作步骤及注意事项.docxVIP

免疫荧光

免疫荧光所用玻片的处理

（1）玻片的规格：圆形18mmX18mm可放入12孔盘；

⑵处理方法：

将玻片一片一片的放入1M的盐酸中，65度浸泡过夜，每一遍均要一片一片的清洗，第一遍用流动的自来水冲洗,，其余在盆里清洗，要洗5次以上，再用蒸馏水洗，同样的方法洗5次以上，再用超声，低功率，一小时。完后再用蒸馏水洗5遍，洗完以后放入95%的乙醇中长期保存。

临用时，在酒精灯上过一下，使玻片上残余的乙醇燃烧，干燥后放入12孔板。

铺板子如细胞难以贴壁（如293T）或需观察细胞骨架的相关指标，需用多聚赖氨酸处理玻片。多聚赖氨酸1ml，置于37度孵箱30-60min，吸干液体，用DDW洗三遍，吸十液体，紫外照射5-10min，晾十。实验前一天将含2-3X10M细胞的单细胞悬液铺种在放有盖玻片的十二孔盘中一个孔中（要保证有单个细胞）。每个条件做两个复孔，待细胞贴壁12?24h后，用于实验分析；

固定用PBS洗涤细胞3次（注意免疫荧光所用的PBS，均为常温的），吸十，4%的PFA1ml/孔于室温固定10min；

防淬灭吸出PFA，注意不能使细胞干燥，用PBS洗3次，加入1ml的50mM氯化铵于室温孵育10min，吸出氯化铵，PBS洗3遍，2-3min/次；（此步可省略）

通透加入1ml的0.1%TritonX-100，10min，吸出Triton，用PBS洗3次，2-3min/次；

封闭加入1ml3%的BSA（PBS配）封闭，室温1h，可在摇床上晃动，吸出BSA，用PBS洗10min；

一抗一般稀释比例为1：200-1：500，将抗体（BSA配；双染各加20pl，单染加40pl）加到封口膜上，将盖玻片从十二孔盘中取出，吸干多余的水分，有细胞的一面接触抗体，室温＞1h或4°C过夜（效果好），将玻片重新放回到十二孔板中，有细胞的一面朝上，用PBS洗4次，10min/次；

二抗稀释比例一般为1：400（BSA配），操作同一抗，避光室温反应1h,将玻片重新放回到用锡纸包裹的十二孔盘中，有细胞的一面朝上，PBS洗3次，10min/次；

DAPI染细胞核一般浓度为川g/ml，每个盖玻片需20ul，操作同一抗，避光于室温反应10min，将玻片重新放回到用锡纸包裹的十二孔盘中，有细胞的一面朝上，PBS洗3次，10min/次；

封片把封片剂（mowoil）滴在载玻片上，每片15^l，将有细胞的面朝下，勿有气泡。等封片剂十后室温约30min-1h，放在4°C，避光保存。若需长期保存，则用封口膜封口后放于-20°C。

若对于定位于核的指标若用上叙的方法做不出，可用下面的方法。

同上

同上

固定用PBS洗涤细胞3次（注意免疫荧光所用的PBS，均为常温的），吸十，1ml/孑L2.5%的PFA于室温固定10min；

通透加入1ml的0.2%TritonX-100（PBS配），10min，吸出Triton，用PBS洗3次，2-3min/次；

封闭加入1ml3%的BSA（0.2%TritonX-100配）封闭，室温1h，可在摇床上晃动，吸出BSA，用PBS洗10min；

一抗一般稀释比例为1：200-1：500，将抗体（BSA配；双染各加20pl，单染加40pl）到保鲜膜或封口膜上，将盖玻片从十二孔盘中取出，吸十多余的水分，有细胞的一面接触抗体，室温＞1h或4°C过夜，将玻片重新放回到十二孔盘中，有细胞的一面朝上，用PBS洗3次，10min/次；

二抗稀释比例一般为1：400（BSA配），操作同一抗，避光室温反应1h,将玻片重新放回到用锡纸包裹的十二孔盘中，有细胞的一面朝上，PBS洗3次，10min/次；

DAPI染细胞核一般浓度为侦g/ml，每个盖玻片需20ul，操作同一抗，避光于室温反应10min，将玻片重新放回到用锡纸包裹的十二孔板中，有细胞的一面朝上，PBS洗3次，10min/次；

封片把封片剂（mowoil）滴在载玻片上，每片15pl，将有细胞的面朝下，勿有气泡。等封片剂十后室温约30min-1h，放在4°C，避光保存。若需长期保存，则用封口膜封口后放于-20°C。