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PCR技术及研究进展;目录;

;PCR技术的特点;引物设计原则

(1)引物长度约为16-30bp。

(2)引物中G+C含量通常为40%-60%。

(3)退火温度=Tm-5

(4)四种碱基应随机分布，在3’端不存在连续3个G或C，因为这样易导致错误。

(5)引物3’端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应,以减少由于密码子摆动产生的不配对。

(6)在引物内,尤其在3’端应不存在二级结构。

;(7)两引物之间尤其在3’端不能互补,以防出现引物二聚体,减少产量。

(8)引物5’端对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点，通常应在5端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。

(9)引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构,以免产生非特异性扩增,影响产量。

(10）简并引物应选用简并程度低的密码子。;PCR技术的原理;;PCR反应条件;（2）引物浓度

0.1-0.5?mol/L

浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。

（3）TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)

0.5-2.5U/50?l

酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。;（4）dNTP

dNTP浓度取决于扩增片段的长度

四种dNTP浓度应相等

浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量

dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。

;（5）Mg2+（DNA聚合酶的激活剂）;2）循环参数

变性

使双链DNA解链为单链

94oC20-30秒

(2)退火

温度由引物长度和GC含量决定。

增加温度能减少引物与模板的非特异性结合，降低温度可增加反应的灵敏性。

;（3）延伸

70-75℃,一般为72℃

延伸时间由扩增片段长度决定

（4）循环次数

主要取决于模版DNA的浓度

一般为25-35次

次数过多：扩增效率降低

错误掺入率增加;1.在10ul反应体系中,加入

模板DNA1ul(10ng)

两种引物各0.2ul(20umol)

10xPCRBuffer1ul

（MgCl21ulrtaq酶需要）

dNTP1ul

Taq酶0.05ul

ddH2O补齐至10ul

2.预变性94℃5-10分钟,

然后30轮循环:

94℃30S，50℃30S，72℃1.5min

3.循环结束后,72℃10分钟，4℃保存。;1）不对称PCR

目的：扩增产生特异长度的单链DNA。

方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。

用途：制备核酸序列测定的模板

制备杂交探针

基因组DNA结构功能的研究

;2)反向PCR(reversePCR);已知序列;3）多重PCR（复合PCR）;4）LP-PCR（Labelledprimers)

;5）锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）;原位聚合酶链式反应（InStillPCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。

直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。

适用于检测病理切片中含量较少的靶序列;7)荧光定量PCR（real-timePCR)

通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。

;9）单一特异引物PCR(SSP-PCR);;;谢

谢

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