口腔免疫研究方法.ppt

细胞凋亡检测样品的制备

将10×的结合缓冲液用蒸馏水稀释成为1×，冰育。悬浮细胞在低温环境中，用PBS洗涤细胞。离心后弃上清，加入预冷的结合缓冲液重悬细胞（细胞浓度为105～106／ml）。加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI于细胞悬浮液中，轻轻混匀。将试管置于冰上，避光孵育10分钟后上机检测。第63页,共70页，2024年2月25日，星期天

微量全血法免疫荧光标记的样品制备

微量全血直接荧光染色法取肝素或EDTA抗凝全血（100μl/份），置12×75mm专用塑料试管中。加入20μl特异性荧光单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗作同型对照，室温下避光染色15min。置Q-PREP仪上溶解红细胞、稳定和固定白细胞，静置5min，上机检测。第64页,共70页，2024年2月25日，星期天微量全血间接荧光染色法取肝素或EDTA抗凝全血（100μl/份），置12×75mm专用塑料试管中。加入50μl特异的单克隆抗体（一抗），室温下孵育30min。置Q-PREP仪上溶解红细胞，稳定和固定白细胞。离心后弃上清液，PBS洗涤细胞。加入50μl荧光（FITC或PE）标记的第二抗体，室温下避光染色30min，上机检测。第65页,共70页，2024年2月25日，星期天

6.相关应用

分子生物学细胞生物学免疫学肿瘤学第66页,共70页，2024年2月25日，星期天

7.口腔举例

牙髓干细胞的初步鉴定收集无牙体牙髓疾病的恒牙，将拔除后的恒牙立即放人预冷含高倍双抗α-MEM培养基中保存，4h内原代取材。体外原代培养的牙髓干细胞放入37℃、5%CO2培养箱中培养3d后弃去未贴壁细胞，PBS清洗后换液。第67页,共70页，2024年2月25日，星期天当第二代牙髓干细胞生长融合成单层后，0.25%胰蛋白酶消化，1：3传代。将扩增到一定数量的第二代细胞消化，PBS混悬后计数，调整细胞浓度（1×106～7/ml），离心后弃去上清。PBS混匀后加入FITC-CD34和PE-STRO-1（stromalcellantigen，基质细胞抗原）混匀，冰盒内避光孵育1h后上机分选。第68页,共70页，2024年2月25日，星期天细胞组成细胞功能大小细胞表面/胞浆/核--特异性抗原粒度细胞活性DNA,RNA含量胞内细胞因子蛋白质含量激素结合位点钙离子,PH值,膜电位酶活性流式细胞仪常检测的细胞特性小结第69页,共70页，2024年2月25日，星期天感谢大家观看第70页,共70页，2024年2月25日，星期天***用于检测血清中抗核抗体、抗平滑肌抗体、抗线粒体抗体等自身抗体。抗核抗体是一组对细胞核内的DNA,RNA,蛋白或这些物质的分子复合物的自身抗体，在多种自身免疫性疾病中呈不同程度的阳性率，如系统行红斑狼疮，结缔组织病，硬皮病等。抗组蛋白，DNA；可提取的核抗原（ENA）；DNASLE常出现核膜型（特异性）、均质型和混合型，斑点型多见于混合性结缔组织病，**免疫荧光技术把显微镜技术的精确性和免疫学检测的特异性和灵敏性结合在一起，可以快速检测病原体，快速诊断方法，广泛应用于病毒、细菌病得诊断，也是许多动物寄生虫（如弓形虫病）的常规诊断方法IFA是弓形虫检测的“金标准，更敏感地检测出早期弓形虫**检测组织中免疫球蛋白、补体、抗原抗体复合物以及肿瘤组织中肿瘤相关抗原的鉴定。**棘层松解，****基底膜损伤在OLP的发病至关重要，MMP能特异降解基底膜的成分BCA**OLP患者中MMP-28表达明显高于正常口腔黏膜组织,且糜烂型表达明显高于其他类型**因此将AnnexinV与PI匹配使用，就可以将细胞凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。*2.WesternBlot基本原理蛋白质混合样品经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）后分离为不同的条带，其中含有能与特异性抗体相结合的待检测的蛋白质（抗原蛋白）。将PAGE胶上的蛋白条带转移到硝酸纤维素膜(nitrocellulosefiltermembrane，NC膜)，此过程称为印迹，以利于随后检测反应的进行。然后，将NC膜与抗体一起孵育，使抗体（一抗）与待检测的抗原决定簇结合（电泳分离的特异性蛋白条带），再与荧光素、酶或核素标记的二抗反应，即可检测出样品中的待测抗原并能对其定量。第31页,共70页，2024年2月25日，星期天

Westernblot原理

第八节口腔免疫学研究的主要方法第32页,共70页，2024年2月25日，星期天Anode-内槽缓冲液带有负电荷，与凝胶