基因工程的操作步骤.ppt

⑥过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链第24页,共46页，2024年2月25日，星期天PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子第25页,共46页，2024年2月25日，星期天目的基因的mRNA单链DNA(cDNA）双链DNA(即目的基因)反转录合成1）反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：3、人工合成的目的基因第26页,共46页，2024年2月25日，星期天二、基因表达载体的构建——基因工程的核心1、目的：所需物质：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。第27页,共46页，2024年2月25日，星期天2、基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因第28页,共46页，2024年2月25日，星期天启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来第29页,共46页，2024年2月25日，星期天①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意第30页,共46页，2024年2月25日，星期天三、将目的基因导入受体细胞---植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力第31页,共46页，2024年2月25日，星期天将目的基因导入受体细胞---动物细胞显微注射法第32页,共46页，2024年2月25日，星期天将目的基因导入受体细胞---微生物细胞Ca2+处理使细胞处于一种能吸收周围环境中的DNA---感受态细胞第33页,共46页，2024年2月25日，星期天四、目的基因的检测与鉴定检测:是否插入目的基因（DNA分子杂交技术）是否转录（mRNA分子杂交技术）是否翻译（抗原—抗体杂交技术）鉴定:功能活性鉴定抗性鉴定分别提取什么进行检测归纳步骤第34页,共46页，2024年2月25日，星期天DNA分子杂交示意图采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。第35页,共46页，2024年2月25日，星期天归纳:基因工程的基本操作程序获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译第36页,共46页，2024年2月25日，星期天第37页,共46页，2024年2月25日，星期天基因操作的基本步骤第38页,共46页，2024年2月25日，星期天基因操作的基本步骤第39页,共46页，2024年2月25日，星期天练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用