因工程制药工艺.ppt

**DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)是一种高效烷化剂。配置：加0.1%DEPC到去离子水中，混匀过夜，然后高温高压121℃，20min，DEPC即降解成二氧化碳和水无毒。**用酚、氯仿法从工程菌中提取的质粒一般有三种构像，即超螺旋，线形和开环。（开环质粒是指双链环状的质粒DNA有部分解链，因此电泳速度最慢）三种构像的质粒在琼脂糖电泳的前后顺序是超螺旋线形开环，线形的质粒在中间，而开环的质粒在最后。判断质粒质粒好坏的一个指标就是超螺旋质粒在所以质粒中的含量。因为用质粒转染真核细胞时，超螺旋的质粒效率最高，所以要求质粒中超螺旋质粒的含量要在90％以上，这也是对作为核酸疫苗重组质粒的要求。**氯化钙法（CalciumChloride）本方法适用于批量制备大肠杆菌感受态细胞，所得感受态细胞可以获得5x106到2x107转化克隆/微克超螺旋质粒DNA材料（MATERIALS）缓冲液和溶液（BuffersandSolutions）（冰冷的）CaCl2?2H2O(1M)冰冷的MgCl2-CaCl2s溶液(solution,icecold)培养基（Media）用于初始培养物培养的LB肉汤（L-brothforinitialgrowthofculture）LBagarplatescontainingappropriateantibiotic核酸（NucleicAcids）质粒DNA（PlasmidDNA）或经过重组的质粒（recombinantplasmid）方法1.从37°C过夜(16-20hours)培养平皿内挑取一个直径约为2到3毫米的单菌落。把这样的单菌落接种于一只装有5毫升LB肉汤的30毫升灭菌试管中，于37°C下振荡培养过夜。2.转移0.2毫升过夜培养物于一只装有15或20毫升LB的50毫升灭菌三角瓶中.于37°C下振荡培养2到2.5小时（此时细菌处于对数生长期）。3.室温下，4000rpm离心5分钟收集对数期细胞。弃培养基，保留细胞沉淀。5.加入10毫升冰冷的MgCl2-CaCl2溶液，并轻微打匀。6.4°C下，4000rpm离心10分钟收集细胞。7.弃MgCl2-CaCl2溶液，保留细胞沉淀。8.加入0.8毫升(每25毫升初始培养物加入1毫升)冰冷的0.1M的CaCl2溶液，并轻微打匀。冰浴放置若干小时为最好。9.此时的感受态细胞可以依照下面的步骤10到16直接进行转化操作，也可以分装,加入甘油后于-70°C冰冻保藏。10.向事先灭菌，并经冷处理的1.5ml聚丙烯管中转移100微升感受态细胞悬浮液。向每个转化管中加入DNA(一般含量是10微升或更低的体积中所含量应不超过50纳克)。细心混匀管中成份。于冰浴放置30到40分钟。11.把转化管转移至放于42°C循环水浴锅中预热的试管架上，准确计时90秒。（此时不能摇动转化管）12.把试管迅速转移至冰浴2到3分钟。13.向每只试管中加入500微升LB肉汤。37°C放置45到90分钟，以使细菌复原，并容许质粒所编码的抗生素抗性的表达。14.转移适量体积（如果使用90毫米平板，一半涂布量不应超过100微升）的经转化处理的感受态细胞涂布于含有相应抗生素的LB-琼脂平板上。15.室温放置平板直到其上液体被吸收。16.于37°C倒置平板培养。转化克隆应该于12-16小时区间出现。1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。**X-gal也称5-Bromo-4-chloro-3-indolyl?β-D-galactopyranoside或5-Bromo-4-chloro-3-indolyl?β-D-galactoside，中文名为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷。分子式为H15BrClNO6，分子量为408.63，CAS?Number?7240-90-6。?

X–Gal是β–半乳糖苷酶（β–galactosidase）的底物，水解后呈蓝色。基于这个特点，pUC系列载体DNA（或其他带有lacZ?基因载体DNA）以lacZ?缺失细胞为宿主进行转化时、或用M13噬菌体载体DNA进行转染时，如果在平板培养基中加入X–Gal和IPTG，由于β–半乳糖苷酶的α–互补性，可以根据是否呈现