固定化酶和固定化细胞.ppt

2.2辅酶的固定方法辅酶的固定方法主要有两种：载体结合法和包埋法。载体结合法与捕基固定方法相似，主要用于制备亲和吸附利。包埋法中，由于辅酶相对分子质量小，先将辅酶与水溶性高分子结合，然后再来包埋。这种包埋和酶的包埋法相似。因此，辅酶固定化包括：引入一个功能基团，生成辅酶衍生物，再与水溶性高分子聚合物结合。2.2.1引入功能基团对于一些腺苷酸的辅酶，如NAD+、NADP+、CoA和ATP等，在腺嘌呤的第6位或第8位上引入氨基或羧基。其反应分别如下：第63页,共85页，2024年2月25日，星期天第64页,共85页，2024年2月25日，星期天第65页,共85页，2024年2月25日，星期天2.2.2高分子化选择高分子化合物时，首先要考虑的是其溶解度大、分子大小适当，既能保持在半适膜内，又不会过大地增加粘度而影响活性；其次是，高分子大小、结构、亲水性、解离基团、结合量等都影响高分子化辅酶的活性。一般引入羧基的辅酶，用碳二亚胺缩合反应使其与聚Lys、聚乙亚胺结合，形成水溶性高分子化合物；引入氨基的辅酶，一般用BrCN活化后，再与水溶性多糖类(如右旋糖苷)结合，而高分子化。酶反应器中，使用高分子辅酶衍生物还有捕酶的再生问题。一般采用与主反应共组合和独立进行二种方式来解决。如下页图：在实践中，许多重要的生物活性物质或生化药物的生物合成中，尚需辅酶参加酶反应，所以，辅酶的固定化和固定化辅酶的再生是酶工程的一项重要任务。目前．尚未见用于工业生产的报道。第66页,共85页，2024年2月25日，星期天第67页,共85页，2024年2月25日，星期天3动植物细胞固定化3.1植物细胞固定化植物细胞比菌体细胞娇嫩得多，需要温和的固定化方法。80年代开始研究，目前一般采用吸附法和包埋法(下表)。第68页,共85页，2024年2月25日，星期天3.1.1吸附法吸附法是将植物细胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内。或吸附于中空纤维外壁上。如将植物细胞定置在中空纤维的外壁与容器内壁之间，培养液及O2在中空维管内流动，透过中空纤维管壁(具半透膜性)，传递给附着于外壁的细胞，细胞代谢产物亦透过外壁随管内培养液流出。利用此法固定的豌豆细胞和胡萝卜细胞进行生产多酚化合物的研究，可连续使用1个多月。又如将洗净、灭茵后的泡沫塑料放进辣椒细胞培养液中，振荡培养一段时间，细胞吸附于塑料孔洞内，并能生长繁殖。3.1.2包埋法包埋法是将植物细胞包埋于琼脂、海藻酸钙、聚丙烯酰胺、明胶和角叉菜胶等多孔凝胶中。Brodelius等(1979)首次用海藻酸钙包埋制备了固定化长春花细胞、毛地黄细胞、海巴戟细胞。第69页,共85页，2024年2月25日，星期天3.2动物细胞固定化动物细胞比菌体细胞、植物细胞更娇嫩．需要最温和的固定化方法。目前,动物细胞固定的方法有吸附法和包埋法两种，其中吸附法用的最多。3.2.1吸附法由于大多数动物细胞属于附着细胞，它们在培养过程中趋向于附着固体表面。因此，吸附法特别适合于制备固定化动物细胞。主要载体及固定方法有：(1)转瓶法。转瓶是由玻璃或塑料制成。其表面经一定处理而带有电荷，如用高锰酸钾等氧化剂，强酸、强碱或紫外辐射等表而处理，可使动物细胞附着于表面，转瓶以一定旋转速度进行培养.若在转瓶内增大表面积，可提高生产能力。(2)微载体法。微载体是指直径为100—200um，相对密度接近于1.0的颗粒固定化载体。它是由表面带有电荷的葡聚糖、明胶、纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成的。微载体具有较大的表面，对细胞生长和物质传递特别有利，但强度不够．易破碎，使用时间较短，已用于固定多种细胞。如用于生产p—干扰素、人纤溶酶原活化剂白细胞介素及各种疫苗的细胞固定化。第70页,共85页，2024年2月25日，星期天(3)中空纤维法中空纤维由聚丙烯、硅化聚碳酸脂等高分子聚合物制成。其管壁具有半透性。将细胞胞置于管外壁扣容器外壳之间，则细胞附着于外壁上，培养液从管内流动，能透过管壁进行质热传递，中空纤维起着体内微血管的作用，有利细胞生长及其新陈代谢。已有多种中空纤维固定化细胞用于生产各种单克降抗体和疫苗等。3.2.2包埋法包埋法根据载体与方法不同，亦有凝胶包埋法和半透膜包埋法两种.(1)凝胶包埋法。用于动物细胞固定化的凝胶主要有琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤蛋白等。琼脂糖包埋法是，将1％一2.5％的琼脂糖加热溶解后冷至37—38℃,与一定量动物细胞混合后．分布于石蜡油中.使温度湖37℃降至10℃左右，可得到直径为0.1—0.3mm的微球状固定化细胞，用于单克隆抗体、白细胞介素等的生产。第71页,共85页，2