原生质体培养和体细胞杂交.pptVIP

PEG法特点：融合频率高可重复性强诱发融合无特异性毒性较低植物+植物植物+动物动物+酵母第三节、原生质体融合（三）PEG法第31页,共41页，2024年2月25日，星期天PEG法原理PEG是一种带负电性的高分子化合物，在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而导致融合。第三节、原生质体融合第32页,共41页，2024年2月25日，星期天最为常用。具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质体----滴加PEG溶液，摇匀，静置---滴加高钙-高pH溶液，摇匀，静置---滴加原生质体培养液洗涤数次---离心获得原生质体细胞团---筛选---再生杂合细胞第三节、原生质体融合（四）PEG结合高钙-高pH诱导法第33页,共41页，2024年2月25日，星期天(五)电融合技术Senda1979年首先用此方法实现原生质体融合第三节、原生质体融合第34页,共41页，2024年2月25日，星期天三、体细胞杂种细胞筛选与鉴定1．互补选择法第三节、原生质体融合2、机械分离杂种细胞法3.双荧光标记选择法第35页,共41页，2024年2月25日，星期天异硫氰酸荧光素（FITC）：绿色异硫氰酸罗丹明（RITC）：红色3.双荧光标记选择法第三节、原生质体融合第36页,共41页，2024年2月25日，星期天四、体细胞杂种植株的鉴定形态学鉴定细胞学观察DNA内切图谱分析同工酶分析第三节、原生质体融合第37页,共41页，2024年2月25日，星期天(1)原生质体培养的意义：(1)再生植株；(2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。(2)原生质体分离方法：机械分离法、酶法分离。(3)酶的种类及特点(4)原生质体的纯化方法：离心沉淀法；漂浮法；界面法。(5)原生质体活力的测定：形态识别；染色识别。第7章原生质体培养与和体细胞杂交本章小结：第38页,共41页，2024年2月25日，星期天（6）原生质体培养方法：液体浅层培养；平板法培养；悬滴法培养；双层培养法；饲喂层培养（7）原生质体融合的方法：无机盐诱导融合；聚乙二醇与高pH高钙相结合的诱导融合；电融合技术。（8）杂种细胞的筛选与鉴定：互补选择；机械分离杂种细胞法；双荧光标记选择法（9）杂种植株的鉴定：形态学鉴定；细胞学观察；DNA内切图谱分析；同工酶分析第7章原生质体培养与和体细胞杂交本章小结：第39页,共41页，2024年2月25日，星期天第6、7章原生质体培养与和体细胞杂交第40页,共41页，2024年2月25日，星期天感谢大家观看第41页,共41页，2024年2月25日，星期天关于原生质体培养和体细胞杂交(1)了解原生质体培养的意义；(2)掌握原生质体分离的大致步骤；(3)掌握原生质体培养的方法；(4)掌握原生质体融合的方凑。第7章原生质体培养与和体细胞杂交本章教学目的与要求第2页,共41页，2024年2月25日，星期天原生质体（Protoplast）含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。第7章原生质体培养与和体细胞杂交第3页,共41页，2024年2月25日，星期天微丝叶绿体线粒体质膜细胞核内质网微管细胞壁高尔基体植物细胞模式图第7章原生质体培养与和体细胞杂交液泡第4页,共41页，2024年2月25日，星期天第一节、原生质体分离及纯化一、原生质体分离双子叶外植体胚性细胞第7章原生质体培养与和体细胞杂交第5页,共41页，2024年2月25日，星期天多数植物分离原生质体的经典材料-----叶肉细胞。第一节、原生质体分离及纯化（一）材料来源禾本科植物：愈伤组织或悬浮细胞。第6页,共41页，2024年2月25日，星期天第一节、原生质体分离及纯化（二）分离方法机械分离法酶法分离法第7页,共41页，2024年2月25日，星期天1、机械分离法（Machanicalisolation）第一节、原生质体分离及纯化优点：

（1）能排除酶的有害影响；

缺点：

（1）原生质体的产量低；

（2）方法繁琐费力；

（3）局限性大第8页