基因工程基本流程筛选与鉴定.ppt

*多抗Blotting结果单抗blotting结果第49页,共56页，2024年2月25日，星期天*4.蛋白凝胶电泳待筛选克隆与非重组子同时进行蛋白质电泳，电泳结束后通过染色对比相应条带辨识重组子。适合受体蛋白表达种类较少，外源基因高效表达的体系。原理：第50页,共56页，2024年2月25日，星期天*选择过程SDS，染色不适于筛选第51页,共56页，2024年2月25日，星期天*5.转译筛选法借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。适用于mRNA转录丰度高的外源基因。原理：第52页,共56页，2024年2月25日，星期天*选择过程mRNA无细胞翻译系统35S标记的甲硫氨酸翻译35S标记的肽链PAGE电泳放射自显影比较放射性带纹的位置载体+外源DNA转录与预期的产物分子量相符？第53页,共56页，2024年2月25日，星期天*6.DNA-蛋白质相互作用筛选检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。ChIP、EMSA、甲基化干扰实验……第54页,共56页，2024年2月25日，星期天*待测蛋白质硝酸纤维素滤膜能与蛋白质结合的DNA序列放射性标记待测蛋白质硝酸纤维素滤膜能与蛋白质结合的DNA序列放射性标记原理：第55页,共56页，2024年2月25日，星期天感谢大家观看第56页,共56页，2024年2月25日，星期天*选择过程1）从重组克隆中提取质粒（或基因组DNA）2）用相应引物进行PCR反应3）电泳PCR产物4）检查是否有PCR产物5）PCR产物的长度是否与外源基因一致原理图p58第17页,共56页，2024年2月25日，星期天*2.Southernblot杂交原理：从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用特异性探针（与目的基因同源）进行核酸杂交。只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。第18页,共56页，2024年2月25日，星期天*选择过程Southernblot流程第19页,共56页，2024年2月25日，星期天*3.菌落/噬菌斑原位杂交原理：特异性探针（与目的基因同源）进行的核酸原位杂交第20页,共56页，2024年2月25日，星期天*探针的制备及标记，p60选择过程第21页,共56页，2024年2月25日，星期天*4.R-环检测法原理：DNA-RNA杂交：外源基因的mRNA与重组载体杂交第22页,共56页，2024年2月25日，星期天*选择过程在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见一种R-环形结构。第23页,共56页，2024年2月25日，星期天*缺点：需要电镜第24页,共56页，2024年2月25日，星期天*5.Northernblotting原理：从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。主要检测插入片断是否被转录。检测表达载体。第25页,共56页，2024年2月25日，星期天*选择过程Northernblot流程第26页,共56页，2024年2月25日，星期天*6.直接电泳检测原理：有插入片段的重组载体分子量比野生型载体分子量大第27页,共56页，2024年2月25日，星期天*选择过程从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。分子量Marker载体重组克隆第28页,共56页，2024年2月25日，星期天*7.限制性酶切图谱法限制性酶切图谱：核酸经限制性内切酶消化成片段，用电泳方法分离，不同的核酸形成的各自独特的条带图谱。第29页,共56页，2024年2月25日，星期天*在外源片段大小及限制性酶切图谱已知的条件下，选择一两种内切酶切割载体，电泳后比较电泳结果(DNA条带数目和分子大小）差异进行区分。或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。原理：第30页,共56页，2024年2月25日，星期天*ABA或B第31页,共56页，2024年2月25日，星期天*不同克隆的酶切结果第32页,共56页，2024年2月25日，星期天*选择过程第33页,共56页，2024年2月25日，星期天*8.DNA序列测定原理：通过对插入片段序列的测定确定是否是所需的重组子第34页,共56页，2024年2月25