基因组学物理图绘制.ppt

3.荧光原位杂交(Fish,Fluorescentinsituhybridization)将探针用荧光标记，与细胞分裂中期的染色体杂交，用荧光显微镜观察信号所处的位置，将探针标定在连锁图上。第29页,共40页，2024年2月25日，星期天分辨率低,敏感性低精细作图对于特定探针,原位杂交所显示的中期染色体荧光信号所处的位置与染色体短臂末端的相对距离不变,经标记可将其标定在连锁图上.分辨力达到25Kb,染色体无法确定外部形态第30页,共40页，2024年2月25日，星期天限制性作图快速，但是不适合大基因组克隆重叠群构建程序复杂，费时费力指纹作图对于大基因组有不少问题，会出现误排原位杂交操作困难，资料积累慢，一次实验定位的分子标记3-4个，第31页,共40页，2024年2月25日，星期天4.序列标签位点作图(STS,SequenceTagedSite)长度:100-500bp序列已知,可以设计PCR反应单拷贝,在染色体上的位置是唯一的EST(Expressedsequencetag)大部分可以作STS第32页,共40页，2024年2月25日，星期天4.1STS作图原理与遗传作图的相似，都是频率决定远近，是断裂频率第33页,共40页，2024年2月25日，星期天4.2寻找STS的方法:表达顺序标签(expressedsequencetag，EST)从cDNA中找到的小段顺序,但基因家族成员间共有的序列不能用于STS。SSLP（simplesequencelengthpolymorphisrns，SSLPs）简单序列长度多态性随机基因组顺序第34页,共40页，2024年2月25日，星期天随机挑选cDNA克隆进行单向、一步大规模测序，将所获得的部分cDNA序列称为ＥＳＴ。

EST是一个cDNA克隆快速大规模测序后所获得的３’端和５’端部分cDNA随机片段，每个EST长度约200～600bp,代表了一个单拷贝基因的部分cDNA表达序列。由于大多数ＥＳＴ的长度不足400bp,说明一个基因转录本的cDNA序列可能包含多个序列重叠的EST，由于一个基因mRNA剪接点不同可以获得多个cDNA克隆，因此EST既可能对应于一个cDNA的某一部分，又可能代表mRNA的不同剪接方式?。任何单一DNA顺序都可作为STS，特别是已在连锁分析中（遗传图中）定位的SSLP，其可建立物理图与遗传图之间的联系。第35页,共40页，2024年2月25日，星期天ESTEST是一个cDNA克隆快速大规模测序后所获得的3’端和5’端部分cDNA随机片段，每个EST长度约200～600bp,代表了一个单拷贝基因的部分cDNA表达序列。第36页,共40页，2024年2月25日，星期天网上克隆1990年，Brenneer等首先提出人类基因组大规模cDNA测序计划以来，Adams等最先采纳并最早建立了表达序列标记技术，他们随机挑选cDNA克隆进行单向、一步大规模测序，将所获得的部分cDNA序列称为EST。由于大多数EST的长度不足400bp,说明一个基因转录本的cDNA序列可能包含多个序列重叠的EST，由于一个基因mRNA剪接点不同可以获得多个cDNA克隆，因此EST既可能对应于一个cDNA的某一部分，又可能代表mRNA的不同剪接方式?。第37页,共40页，2024年2月25日，星期天4.3STS的物理图定位辐射杂种作图不能合成胸苷激酶(TK)或次黄嘌呤磷酸转移酶(HPRT)的缺陷性细胞从人体细胞中获得编码TK和HPRT基因的细胞培养基中添加次黄嘌呤、氨基蝶呤辐射杂种群PCR检测STS标记，根据STS出现频率，判断标记是否连锁及连锁程度第38页,共40页，2024年2月25日，星期天用STS构建Contig第39页,共40页，2024年2月25日，星期天感谢大家观看第40页,共40页，2024年2月25日，星期天**片段大小相同，限制性位点过多末端同位素标记，部分酶解50kbDNA的精确作图，6碱基限制酶******1。**notI1000Kb果蝇和酵母缺少甲基化修饰，**********B1和B2相对位置，仅适用于小基因组和小区段染色体的物理图绘制，慢**B杂交技术，重复序列的杂交**************X射线PEG或仙台病毒关于基因组学物理图绘制遗传图的缺点遗传图的分辨率有限基因组测序和组装所要求的标记密度是100kb。遗传图的覆盖面较低重组热点，倒位区段