功能蛋白质组学研究方法.ppt

****************************3在疾病的治疗和致病机理方面的研究有研究以HCV非结构蛋白NS4A作为固相靶分子，用T7噬菌体表面展示的人肝细胞cDNA文库进行5轮筛选后，确定了与HCV非结构蛋白NS4A结合的是肝细胞蛋白丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）激活蛋白激酶5（MAPKAPK5），为进一步研究HCV的致病机制奠定了基础。第21页,共34页，2024年2月25日，星期天酵母双杂交系统

酵母双杂交技术由Fields等人于1989年提出。该技术利用了酵母转录因子GAL4性质，GAL4包括两个彼此分离但功能上必需的结构域,一个是位于N端1-174位氨基酸残基区段的DNA结合(DNAbindingdomain,DNA-BD),另一个是位于C端768-881位氨基酸残基区段的转录激活域(Activationdomain,AD）。第22页,共34页，2024年2月25日，星期天DNA-BD能够识别GAL4效应基因的上游激活序列(Upstreamactivatingsequence,UAS),并与之结合，而AD则通过与转录机制中的其他成分之间的作用,启动UAS下游的基因进行转录。DNA-BD和AD单独作用均不能激活转录反应,只有当二者在空间上充分接近并呈现完整的GAL4转录因子活性时,方可激活UAS下游启动。第23页,共34页，2024年2月25日，星期天该系统中转录激活的条件是蛋白质作为一个整体起作用。分别经分子克隆技术在同一细胞中表达的BD和AD多肽不会彼此间发生作用，BD和AD分别可以同其他蛋白质X或Y结合形成融合蛋白,如果X，Y之间可以形成蛋白-蛋白复合物,使GAL4两个结构域重新构成AD和BD成为一体,就可以启动特异基因序列的转录。第24页,共34页，2024年2月25日，星期天GAL4重建后激活转录模式图BDADXYUAS报告基因（LacZ）第25页,共34页，2024年2月25日，星期天一般地,将BD-X的融合蛋白称作诱饵(bait),X往往是已知蛋白,AD-Y称作猎物(prey),能显示诱饵和猎物相互作用的基因称报告基因,通过对报告基因的检测,反过来可判断诱饵和猎物之间是否存在相互作用。第26页,共34页，2024年2月25日，星期天作为一种分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的简便而有效的研究体系,酵母双杂交的最大的优点是不需要分离、纯化蛋白质,整个过程只是对核酸进行操作。第27页,共34页，2024年2月25日，星期天酵母双杂交系统应用

它主要应用在以下几个方面:1.用于验证通过其他方法发现的蛋白质之间是否有相互作用;2.确定已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构域;3.筛选文库以得到与已知蛋白质存在特异相互作用的候选蛋白质。第28页,共34页，2024年2月25日，星期天酵母双杂交系统的局限性1.并非对所有蛋白质都适用双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于核内,而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工,如糖基化,二硫键形成等,这些反应在核内无法进行。另外,有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其它非酵母蛋白的辅助,这限制了某些细胞核外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。第29页,共34页，2024年2月25日，星期天2.假阳性的发生假阳性分为两类：一类是生物学上的假阳性即蛋白质与蛋白质的相互作用在酵母细胞中发生,但是在其生物体细胞内并不发生相互作用，这主要是因为两种蛋白不同时表达或者二者根本不在同一组织中，这种假阳性,我们如果对所研究的蛋白质的生物学特性没有深入了解的话,是很难排除的。第30页,共34页，2024年2月25日，星期天另一类是技术上的假阳性即由于双杂交技术上的局限而鉴定出的蛋白质与蛋白质间的相互作用。包括筛库过程中自发升高的BD-x融合蛋白自我激活导致的假阳性，在BD-x融合蛋白不存在的情况下AD-Y融合蛋白单独激活报告基因，导致的假阳性,以及酵母中其他蛋白质作用引起的假阳性等。第31页,共34页，2024年2月25日，星期天因此，虽然双杂交系统可筛选出大量蛋白质相互作用,但其中部分蛋白质在生理状态下可能不发生相互作用,双杂交只是反映蛋白质间能发生作用的可能性,这种可能性还必须经过其他实验验证,尤其要与生理功能研究相结合,否则可能会误入歧途。第32页,共34页，2024年2月25日，星期天酵母双杂交体系的新发展传统酵母双杂交体系的改建根据酵母的营养缺陷,发展了多重筛选机制表达载体构建的改进将蛋白的相互作