免疫学方法及其应用.ppt

第七章免疫学方法及其应用四、现代免疫技术免疫荧光技术基础上发展起来的血清学检验方法。一种酶作标记的抗体或抗抗体的高灵敏度的免疫标记技术。原理：利用酶与抗原或抗体结合后，既不改变抗原或抗体的疫学反应特异性，也不影响酶本身的活性，在特异抗原抗体反应后，于相应而合适的酶底物作用下，产生可见的不溶性有色产物。与免疫荧光技术区别：有色的沉淀物可在光学显微镜下进行细胞水平的抗原追踪，也可在电子显微镜下进行分子水平的观察，又能用分光光度计定量测定酶作用底物分解的量。2、免疫酶技术（酶免疫测定技术）目前常用辣根过氧化物酶(HRP)，也有用碱性磷酸酶标记抗体第二节抗原与抗体反应及其应用第53页,共70页，2024年2月25日，星期天2、免疫酶技术（酶免疫测定技术）（1）酶联免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbantassay，ELISA，酶标法)ELISA是目前应用最广泛的生物学技术之一。原理：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。ELISA试验中需要有3种试剂：①固相的抗原或抗体。目前多用聚苯乙烯酶标板(微量滴定板)作为固相载体②酶标记的抗原或抗体。③酶作用的底物。第二节抗原与抗体反应及其应用四、现代免疫技术第54页,共70页，2024年2月25日，星期天抗原捕获ELISA第55页,共70页，2024年2月25日，星期天1、把抗体固定在固相支持物上（96孔板）；2、加入蛋白质样品保温，再洗去未结合的杂蛋白；3、加入第二抗体，第二抗体结合一个供检测用的酶（辣根过氧化物酶）4、洗去未结合第二抗原，酶活测定。第56页,共70页，2024年2月25日，星期天第57页,共70页，2024年2月25日，星期天ELISAforHIVantibody

MicroplateELISAforHIVantibody:colouredwellsindicatereactivity第58页,共70页，2024年2月25日，星期天第七章免疫学方法及其应用2、免疫酶技术（酶免疫测定技术）（1）酶联免疫吸附法优点：①灵敏度高，特异性强。②酶标抗体制备容易，且高度稳定而有效期长。③操作简便④应用范围广泛。ELISA技术用于检测多种病原菌抗原或抗体、血液及其他体液中微量蛋白成分、细胞因子等。在食品加工领域，ELISA技术可用于测定蛋白质，也可用于测定各种生物活性成分，如异黄酮半抗原。在食品安全方面，用于检测食品中农药残留，以及检测食品中的病原菌及其毒素，如沙门氏菌及其内毒素和肠毒素、大肠杆菌及其肠毒素和肠细胞出血毒素、金黄色葡萄球菌及其肠毒素、霉菌和真菌毒素。第二节抗原与抗体反应及其应用四、现代免疫技术第59页,共70页，2024年2月25日，星期天第七章免疫学方法及其应用2、免疫酶技术（酶免疫测定技术）（1）酶联免疫吸附法ELISA方法：将可溶性抗体或抗原吸附到聚苯乙烯等固相载体上，再滴加酶标记的抗原或抗体，然后添加底物，进行免疫酶反应，以酶标仪测定。①双抗体夹心法本法用于检测抗原。图7-11双抗体夹心法测抗原示意图标本（含抗体）酶标抗体底物固相抗体第二节抗原与抗体反应及其应用四、现代免疫技术第60页,共70页，2024年2月25日，星期天第七章免疫学方法及其应用2、免疫酶技术（酶免疫测定技术）（1）酶联免疫吸附法②间接法图7-11间接法测抗原示意图标本（含抗体）酶标抗体底物固相抗原第二节抗原与抗体反应及其应用四、现代免疫技术第61页,共70页，2024年2月25日，星期天第七章免疫学方法及其应用2、免疫酶技术（酶免疫测定技术）（1）酶联免疫吸附法③斑点酶免疫吸附法(dot-ELISA)本法原理与上述两法相同，方法上的不同之处是：A用硝酸纤维薄膜取代上述微量滴定板；B最终显色反应是不溶于水的有色沉淀物，例如，碱性磷酸酶的底物不能用对硝基酚磷酸盐，而要用氮蓝四唑(NBT)等。最终可从薄膜上沉淀物颜色的有无或多少确定结果。优点：灵敏度高(比普通ELISA高10～100倍)，与放射免疫测定相当。第二节抗原与抗体反应及其应用四、现代免疫技术第62页,共70页，2024年2月25日，星期天第七章免疫