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mTOR和eIF4E蛋白在大肠癌组织中的表达及临床意义

【摘要】目的研究真核翻译启动因子eIF4E(eukaryoticinitiationfactor4E)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)在结直肠癌中的表达和其对应的临床病理之间相互关系，寻找在大肠癌的发生、进展过程中eIF4E及mTOR的作用；研究两者之间的有无关系。方法外科手术中获取大肠癌组织及癌旁组织各60例（要求手术患者在手术前未进行全身化疗、放疗及其他治疗），采用逆转录酶聚合酶链反应技术及酶联免疫法检测大肠癌组织及癌旁组织中mTOR和eIF4E基因的RNA水平和蛋白水平表达变化。结果1、分别用RT-PCR法和酶联免疫法检测结果显示：大肠癌组织中mTOR和eIF4E基因的表达明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P0.05)。mTOR和eIF4E基因RNA表达与性别、年龄、临床TNM分期差异无统计学意义(P0.05)，在不同肿瘤分化程度以及有无淋巴结转移上差异有统计学意义(P0.05)。2.相关性分析显示mTOR和eIF4E在大肠癌中的表达呈显著正相关(P0.05)。结论mTOR和eIF4E基因的过度表达在大肠癌的发生、发展中起重要作用，mTOR和eIF4E基因的表达与大肠癌的分化程度及淋巴结转移情况有相关性;联合检测两者在大肠癌中的表达可能有助于恶性程度的评估与预后判断。【关键词】大肠癌mTOReIF4E职称论文大肠癌是发生于大肠部位的常见的消化道恶性肿瘤，居于消化道道肿瘤的第3位。mTOR信号通路是细胞内重要的生存信号转导通路，该通路的激活与肿瘤细胞的增殖、分化、逃避凋亡、耐药及血管生成密切相关[1]。哺乳动物雷帕霉素靶(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)和真核细胞翻译起始因子(eukaryoticinitiationfactor4E)是mTOR信号通路中的两个重要的分子[2，3]。本实验拟观察试图通过收集大肠癌及癌旁组织中对mTOR信号通路的mTOR、eIF4E两个基因的检测，更进一步完善对大肠癌组织的早期诊断和预后判断提供一个新的思路。1对象与方法1.1研究对象收集2010年l0月至2012年6月来自乌海市第三人民医院的结肠癌根治术后癌及癌旁标本各60例．其中男28例、女32例，年龄22～80岁，按全国结直肠癌协作组1986年标准进行组织学分类，其中高分化l6例，中分化26例，低分化18例，TNM分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期分别为13、23和24例，其中淋巴结转移38例。1.2实验方法按一步Trizol法提取样本组织的RNA：按说明书配制20ul的RT反应液（反应液配制请在冰上进行）。1TotalRNA用量为1ug。反转录反应条件如下:37℃15min，85℃5sec按说明书配制50ul的PCR反应液，94℃30sec，56℃*15sec，25Cycle72℃30sec。设循环25个，实验采用GAPDH片段作为内参照。mTOR、eIF4E、GAPDH引物采用Oligo软件进行设计，由invitrogen公司合成（具体序列见表一）。取PCR产物5ul，加5xLoadingBuffer2ul，2%琼脂糖凝胶电泳110V，100mA，25min，凝胶成像仪成像并保存结果。表1PCR引物详细序列：1.3按酶联免疫法（ELISA）试剂盒说明书检测mTOR，eIF4E基因蛋白表达计算：根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样本的OD值，在回归方程上计算出对应的样品浓度，也可以使用各种应用软件来计算。最终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。1.4统计学处理实验数据采用表示，组间比较采用t检验，两组以上比较采用方差分析，相关分析采用直线相关分析法分析。以SPSS13.0统计软件进行统计学分析。P0.05为差异有统计学意义。2结果RT-PCR、Elisa法检测大肠癌及癌旁组织mTOR、eIF4E基因RNA水平的表达和蛋白表达结果一致。结果显示：大肠癌mTOR、eIF4E基因表达量结果一致，癌组织明显高于癌旁组织，差异显著有统计学意义（P0．05）（见图1，2，表2，4）。相对应内参基因GAPDH表达无差异（见图3）。大肠癌组织中mTOR、eIF4E基因表达与年龄、性别、TNM分期无关(P0.05)，与组织分化程度、淋巴结转移有关(P0.05)（详见表3，5）。mTOR基因和eIF4E基因相关性分析：60例大肠癌标本RT-PCR法检测mTOR基因和eIF4E基因灰度值相关性分析统计处理后结果为：r