地高辛标记探针的Southern印迹方案.docx

地高辛标记探针的DNA印迹方案SouthernblotusingDIGProber

(分子生物学实验室)

StepI采用地高辛高效标记混合物(ROCHE)标记DNA探针

以质粒为模板，PCR扩增序列特异性片段，回收片段，并测定浓度

浓度测定：将回收产物取1μl稀释5倍，标准分子量的标记物MAKER分别点1μl，2μl，4μl，6μl.然后比较回收产物的条带亮度与MAKER比较后，可以粗略估算浓度。

取1μg模板（第1步扩增回收产物）于1.5ml的eppendorf管中，加入灭菌双蒸水至终体积为16μl。

沸水浴处理10min后迅速于冰上冷却使DNA变性

（1）摇匀DIG-HighPrime（vial1），取4μl加入已热变性的模板DNA中，混匀后，瞬时离心，37℃保温20h，65℃处理10min终止反应。

取１μl电泳检测，标记后的条带稍大于标记前片断。５标记好的DNA探针－20℃保存。

StepII基因组DNA酶切

提取高质量的基因组DNA，浓度1μg/μl;测定浓度的方法同测定探针浓度方法一样。

选择合适的内切酶（酶切的DNA量20μg左右。注意考虑到纯化的损失，约30%，酶切DNA浓度过大时，可以考虑多做几管做浓缩）。

50μl酶切反应体系：

EcoRI(15U/μl) 5μl

10×Mbuffer 5μl

gDNA 10μl（约10-20μg）

ddH2O upto50μl

注：有些内切酶需加BSA，请参照内切酶说明（包括最适酶切温度）。

37℃酶切12h（电泳检测），视酶切情况可延长酶切时间，直至酶切完全。

37℃酶切12h

65℃保温10min停止酶切反应。

StepIII预电泳和电泳

配制0.8%的琼脂糖凝胶（大胶40ml左右，胶薄较好，利于转膜）。

加入适量上样缓冲液（LoadingBuffer）点样，点上质粒做对照。

注：两边的点样孔尽量空出来；点上marker,再单独一点样孔用溴酚兰做指示，防止跑过。

120V，5min；40V，4h。溴酚蓝前沿跑至胶边约1厘米处即可。

StepIV转移胶处理与转膜

电泳后用EB染色，紫外光下拍照，然后，切下marker和右上方一角。

1凝胶在灭菌的双蒸水中漂洗片刻。

2.室温下凝胶在0.25MHCl中浸泡15min，使DNA脱嘌呤，摇床上缓慢摇动，

（溴酚蓝由蓝色变为黄色）灭菌的双蒸水中漂洗凝胶。

凝胶转移到10倍于凝胶体积的变性液（1.5MNaCl，0.5MNaOH）中轻轻振荡20min；换液一次，继续漂洗20min。

灭菌的双蒸水漂洗凝胶片刻，然后置于10倍于凝胶体积的中和液中轻轻振荡20min，换中和液重复一次。

换培养皿，用20×SSC转移缓冲液漂洗一下仪器：大培养皿3套

换洗过程很重切记清顺序

StepV转膜

将尼龙膜漂浮于超纯水中至完全浸润，转移至20×SSC转移缓冲液中浸泡

15min。先尼龙膜再倒水和缓冲液，保证完全浸润。

组装转移装置：玻璃板+滤纸桥(边缘完全充分浸入20×SSC转移缓冲液)+1张滤纸+凝胶(背面朝上)+尼龙膜（做好标记）+滤纸（3层）+吸水纸+玻璃板+500g重物（如下图）

方向

注意每层都要用玻棒排净气泡。

毛细转移装置如图。在20×SSC转移缓冲液中毛细转移24h，为提高转膜效

果可以适当延长时间；转膜期间经常更换吸水纸及加液（注意防止短路！！：用

封口膜在四周封好，防止膜上吸水纸接触到膜下缓冲液）。

转膜结束后，凝胶拍照检测DNA残留状况。

取膜，（用铅笔标记样品孔的位置，切角标示方向）

毛细转移法具体步骤：

20×SSC浸湿一张whatman3mm滤纸放在支撑平台上，此平台要比凝胶稍大，形成一个“桥”。

凝胶反放在浸湿的whatman3mm滤纸上注意两者之间不能有气泡。3．用塑料膜包裹膜的边缘，照凝胶的大小剪一张尼龙膜。4．膜（20×SCC平衡过）放在凝胶上。

5．尼龙膜上放一张whatman3mm滤纸、一叠吸水纸、上置一玻璃板，其上放一重约0.2～0.5kg的物品。

6．20×SCC的转移缓冲液中充分转移18～24h及时换掉浸湿的吸水纸。

StepVI固定，预杂交，杂交

将尼龙膜浸入6×SSC溶液中2～5min，除去黏附在膜上的凝胶碎片。

固定：把膜放在两层干燥的吸水纸中央，80℃烘烤2h。处理后的膜直接用于杂交或用保鲜膜包裹干燥保存于冰箱。

配制地高辛杂交液：用 64ml 的无菌超纯水分两次加入 DIG Easy Hyb

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