外源DNA片段与表达载体的重组实验报告讨论分析.pdf

外源DNA片段与表达载体的重组实验报告讨论分析

一、实验目的和要求

基因工程实验是生物实验中极具代表性的一部分，在此次实验

中有如下目的和要求：

1、通过本实验了解和掌握含GFP基因质粒的提取和琼脂糖DNA

电泳的等十个小实验组合而成的基因工程实验的原理和技术。

2、了解生物实验的完整流程，对实验室基本操作规范与仪器设

备使用方法得到初步了解，从而建立系统、有条理的实验思路。

3、培养实验动手能力，在实践中加强对专业知识的认知与体

会，融汇贯通，寓学于用，感受生物学科的魅力。

二、实验内容和原理

基因工程又称DNA重组技术，是将不同来源的基因按照预先设

计的蓝图，在体外构建成杂种DNA分子（又称重组DNA分子），然后

导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种和生产新产

品等。基因工程技术为生命科学的研究提供了有力的手段，同时为

以基因工程技术为核心的现代生物技术产业的建立奠定了扎实的基

础。

基因工程技术建立的标志性实验是：①1972年，美国斯坦福大

学的伯格(P.Berg)等人将猿猴病毒SV40的DNA和大肠杆菌λ噬菌

体DNA分别进行EcoRI酶切，然后用TDNA连接酶将两个酶切片段进

行连接，率先完成了人类历史上第一个DNA分子的体外重组实验，

因此荣获了1980年的诺贝尔化学奖。②1973年，美国斯坦福大学

的科恩（S.Cohen）等人在体外构建了含四环素和链霉素两个抗性基

因的重组质粒，并将其导入大肠杆菌中，获得了双抗性的大肠杆菌

转化子，成功完成了第一个基因克隆实验。上述两大科研成果标志

着基因工程技术的诞生。

一个典型的基因工程技术包含以下几个步骤：

1.目的基因和载体DNA的获取。

2.目的基因和载体DNA的限制性内切酶的酶切消化。

3.酶切后的目的基因和载体DNA的体外重组连接，以获得重组

DNA分子。

4.通过细菌转化等技术，将重组DNA分子导入细菌等活细胞。

5.转化细胞的筛选鉴定以及目的基因表达的检测。

其中目的基因、载体、工具酶及宿主细胞是缺一不可的，因此

被称为基因工程的四大要素。

实验一含GFP基因质粒的提取

目前获取目的基因DNA片段常用方法是：从GeneBank中查得

目的基因的DNA序列，根据序列设计引物，通过PCR的方法扩增目

的基因的DNA片段。根据目的基因的来源不同，用于PCR扩增的模

板DNA，大致有两个来源：①由于真核细胞DNA的基因编排方式，

是由内含子和外显子等组成，因此，只能通过提取目的基因mRNA，

逆转录合成出cDNA，为PCR的模板。②原核生物的DNA其基因是连

续的。因此提取原核细菌的DNA，就可用于PCR的扩增。本次实验

的目的基因就是来自一种细菌编码的脂肪酶基因。

细菌基因组DNA的提取先是用溶菌酶及蛋白酶K裂解细胞，释

放DNA、RNA及蛋白质等。然后用苯酚/氯仿处理，使蛋白质变性，

经离心去除蛋白质及细菌碎片，DNA和RNA存在于上清水相中，然

后用RNase分解RNA，酒精沉淀DNA，即可获取目标基因组DNA。

实验二琼脂糖DNA的电泳

DNA分子是两性电解质，在溶液中形成兼性离子而携带电荷，

带电分子在电场中将产生移动，这种现象称为电泳。带电分子在电

场中移动的快慢，除受到场强、缓冲液类型及缓冲液离子强度等外

界因素的影响外，还受到分子的大小、带电量及分子的形态等自身

因素的影响。为避免断电后电泳分开不同DNA分子的迅速扩散混

合，DNA电泳常采用琼脂糖的凝胶电泳。

实验三PCR扩增目的基因

1985年美国Cetus公司的穆利斯等人设计并研究成功了一种体

外核酸扩增技术PCR（PolymeraseChainReaction），从而荣获了

1993年诺贝尔化学奖。这种聚合酶链式反应是一种类似于细胞内

DNA的天然复制过程，利用半保留复制的原理，以待扩增的DNA为

模板，在体外由引物介导的酶促合成特异的DNA片段。将目的基因

DNA在高温（94℃）下解链成为单链模板；人工合成的一对与目的

基因两侧序列相互补的寡核苷酸引物在低温（40～60℃）下分别与

变性的目的基因片段两侧的两条链的部分序列互补结合；在Taq中

等