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标准菌种确认标准操作规程

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一目的

建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。

二范围

本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。

三内容

1.1试验菌株

大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102]

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC(B)26003]

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）[CMCC(B)63501]

白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC(F)64941]

黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC(F)98003]

铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）[CMCC(B)10104]

生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）[CMCC(F)98001]

1.1.1

1.1.1

1.1.1

1.1.1

1.1.2

1.1.2.1

1.1.2.2工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认

1.2菌种确认试验的主要内容

1.2.1

1.2.1

1.2.1

①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。

②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。

1.2.2菌种的特

1.2.2

1.3菌种的确定方法

用无菌接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及菌形。再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。

1.3.1

1.3.1

1.3.1.1.1取大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经35℃培养18～

1.3.1.1.2取上述培养物接种于曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板和麦康凯琼脂平板上，35℃培养18～

①曙红亚甲蓝琼脂(EMB)平板上菌落形态呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，常有金属光泽。

②麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。

1.3.1

1.3.1

①以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取菌落形态（①、②）的培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温，再通过火焰2～3次干燥使固定。

②滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。

③滴加碘液，媒染1min，水洗，以滤纸吸干余水。

④滴加95﹪乙醇，脱色20～30s，至流出液无色，水洗。

⑤滴加沙黄染液，复染1min，待干后，镜检。

1.3.1.2.2染色结果应是：革

1.3.1.2.3镜检结果应是：

1.3.1

1.3.1.3.1靛基质试验（I）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于蛋白胨水培养基中，培养24-48h，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液

1.3.1.3.2甲基红试验（M）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2h，于培养液中加入甲基红指示液2～

1.3.1.3.3乙酰甲基甲醇生成试验（V-P）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2h，，于2ml培养液中加入α

1.3.1.3.4枸橼酸盐利用试验（C）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于枸橼酸盐

1.3.1.3.5乳糖发酵试验：取菌落形态（①、②）的培养物接种于乳糖发酵管，培养24-48h，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色：指示剂

1.3.2

干燥、皱缩、无典型卷发状。

1.3.3

1.3.3

1.3.3

1.3.4

1.3.4

1.3.4.1.1取白色念珠菌新鲜培养物至沙氏葡萄糖肉汤培养基中，经35℃培养24～48h后，

1.3.4.1.2取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，经30～35℃培养24～48h（必要时延长至72小时）观察结果：

1.3.4.1.3取上述（5.3.4.1.2）培养物接种至白色念珠菌显色培养基平板上，经30～35℃培养24～48h（必要时延长至72小时）观察结果

1.3.4

取上述（5.3.4.1.3）培养物接种至1