基因工程的酶学基础.ppt

4．绿豆核酸酶（MungBeanNuclease）绿豆核酸酶来源于绿豆芽，与Sl酶相似，但比Sl酶更温和。在大切口上才切割，更容易使双链DNA突出端变成平端。5．核糖核酸酶A（RibonucleaseA或RNaseA）核糖核酸酶A来源于牛胰，为内切核酸酶，可特异攻击RNA上嘧啶残基的3端。可除去DNA:RNA中未杂交的RNA区，可用来确定DNA或RNA中单碱基突变的位置。广泛用来去除DNA样品中的RNA。核糖核酸酶A商品制剂可能会污染其它酶（如DNA酶），使用前应加热使DNA酶失活6．脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）DNaseⅠ来源于牛胰，是内切核酸酶，可优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA。在Mg2+存在下，独立作用于每条DNA链，且切割位点随机。在Mn2+存在下，它可在两条链的大致同一位置切割dsDNA，产生平端或1-2个核苷酸突出的DNA片段。DNaseⅠ用途广泛，如切口平移标记时在dsDNA上随机产生切口；在闭环DNA上引入单切口，以将分子截短（在亚硫酸氧盐介导的诱变前）；建立随机缺失的嵌套缺失体，用于功能分析或测序；在DNA酶足迹法（DNAfootprinting）中分析蛋白:DNA复合物；除去RNA样品中的DNA。7．核糖核酸酶H（RibonucleaseH或RNaseH）核糖核酸酶H是内切核酸酶，特异性水解与DNA杂交的RNA上的磷酸二酯键，产生带有3-OH和5磷酸末端的产物，不降解单链核酸、dsDNA或dsRNA。许多酶附带有该酶的活性，如AMV反转录酶。

???主要用于在cDNA克隆合成第二链之前去除RNA；在脱氧核苷酸指导下在特异位点切割RNA四、其他蛋白质降解酶类：蛋白酶K外源DNA导入，核酸和蛋白质的提取：溶菌酶，zymolyase，glusulase，NovoZyme，溶壁酶，纤维素酶检测酶类抗生蛋白链素β-半乳糖苷酶,碱性磷酸酶,辣根过氧化物酶六、反转录酶（Reversetranscriptase）反转录酶即依赖于RNA的DNA聚合酶，它有5--3合成DNA活性，但是无3--5DNA外切活性。它来自AMV（禽成髓细胞瘤病毒）或Mo-MLV（Moloney鼠白血病病毒，又称M-MuLV）1.AMV反转录酶2.M-MLV反转录酶七、末端转移酶（terminaltransferase）分子克隆中常用的末端转移酶来源于小牛胸腺，是一种不依赖于模板的DNA聚合酶。在二价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的3‘羟基端。它不需要模板，可以用含有3’-OH的ＤＮＡ片段为引物，在3’-OH端加入核苷酸达几百个。它作用的底物可以是具有3’-OH末端的单链DNA,也可以是具有3’-OH突出末端的双链DNA用途：1.催化非放射性的标记物掺入到DNA片断的3’-末端：生物素等，掺入后可产生荧光染料或抗生物素蛋白结合物的接受位点。2.用于在平头ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。第三节DNA连接酶（DNALigase）连接酶就是将两段核酸连接起来的酶，相当于基因工程中的“糨糊”。现已发现几种不同来源或作用于不同底物的连接酶。定义：催化DNA上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露的3‘羟基和5’磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的DNA裂口连接起来。?1．T4DNA连接酶（T4DNAligase）T4DNA连接酶的分子量为68kDa，催化DNA5磷酸基与3羟基之间形成磷酸二酯键。反应底物为粘端、切口、平端的RNA（但效率低）或DNA。低浓度的聚乙二醇PEG（一般为10%）和单价阳离子（150-200mMNaCl）可以提高平端连接速率。连接反应条件需要ATP，若在16℃反应，大约需4小时；若在4℃反应，则需反应过夜。T4DNA连接酶的作用机制：此反应是由焦磷酸(ppi)的水解作用激发的需要花费两个高能磷酸键连接酶的作用机理修复与RNA结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键连接多个平末端双链DNA分子影响连接的因素温度：多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15℃以下,然而保持连接酶活性的最适温度却是37℃,因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷。经常采用12.5℃（4-15℃）。Tm值