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淡水生物监测环境DNA定量PCR法

1范围

本文件规定了利用环境DNA定量PCR技术监测淡水生物的方法和质量控制与质量保证。

本文件适用于淡水生生物类群或物种监测，包括浮游植物、着生藻类、水生维管束植物、浮游动物、

大型底栖无脊椎动物和鱼类等。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T19495.5-2018转基因产品检测实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测方法

HJ494水质采样技术指导

HJ710.8生物多样性观测技术导则淡水底栖大型无脊椎动物

SC/T9402淡水浮游生物调查技术规范

SN/T4278—2015国境口岸医学媒介昆虫DNA条形码鉴定操作规程

SN/T4835实验室生物废弃物管理要求

DB32/T4178河流水生态监测规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

荧光定量PCRquantitativereal-timepolymerasechainreaction

实时荧光定量PCR即定量PCR，在聚合酶链式反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号积累实时监测

整个PCR进程，并通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

[来源：GB/T19495.5-2018，3.1.3，有修改]

环境DNAenvironmentalDNA；eDNA

环境介质（水、土壤、沉积物、生物膜、空气等）或混合生物组织中存在的生物遗传物质（DNA）。

Ct值cyclethreshold

每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

[来源：GB/T19495.5-2018，3.1.5]

阴性对照negativecontrol

在实验过程中，与受试样品平行进行的，用确定不含DNA的样品代替受试样品进行的对照反应，用

于观察整个反应体系是否正确，确认没有受到污染。

[来源：SN/T4278—2015，3.7，有修改]

阳性对照positivecontrol

在实验过程中，与受试样品平行进行的，且预期产生已知阳性结果的样本，用于观察整个反应体系

和反应过程是否正常，确认没有受到污染。

[来源：SN/T4278—2015，3.6，有修改]

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4试剂

无菌水。

无水乙醇：分析纯。

环境DNA保存液。

DNA提取试剂。

定量PCR预混液。

扩增引物和探针。

5设备和材料

样品采集及前处理设备

5.1.1竖式采水器：2L或5L。

5.1.2水样抽滤设备，具备废液直排功能。

5.1.3沉积物采样装置：抓斗、采泥器等。

5.1.4着生藻类采集器具：毛刷、刀片、托盘、洗瓶等。

5.1.5浮游生物网：孔径64µm。

5.1.6大型底栖无脊椎动物采集装置：彼得生采泥器、D型抄网、踢网、索伯网、40目的筛网等。

实验室分析设备

5.2.1均质仪，速度不小于6m/s。

5.2.2冷冻干燥仪。

5.2.3真空离心浓缩仪。

5.2.4超微量紫外分光光度计：测量体积最小1µL，波长范围包括230nm、260nm和280nm。

5.2.5荧光定量PCR仪。

其他辅助设备和材料

5.3.1低温冰箱：4℃、-20℃和-80℃。

5.3.2采样瓶：100mL和1000mL等。

5.3.3照相器具：照相机或摄像机等。

5.3.4微量移液器：0.5µL～10µL、20µL～200µL和100µL～1000µL等。

5.3.5通用无菌手套。

5.3.6离心管：1.5mL、2mL、5mL和50mL，无DNA和生物残留。

5.3.7无菌微孔滤膜：0.22µm、0.45µm、1.2µm和5µm等。