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普通光学显微镜的使用及革兰氏染色法

普通光学显微镜的使用及革兰氏染色法

摘要：微生物的最显著特征就是个体微小，一般必须借助显微镜才能观察到它们的个体形态

和细胞结构。熟悉显微镜和掌握其操作技术是研究微生物不可缺少的手段。革兰氏染色法是

细菌学中重要的鉴别染色法，可以区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。本实验只要是学习并

掌握油镜的使用及革兰氏染色的方法和步骤，巩固平板划线分离法及无菌操作技术。

关键词：显微镜油镜革兰氏染色法

1前言

1.1实验目的

1.学习并掌握普通光学显微镜及油镜的原理和使用方法。

2.掌握利用显微镜观察不同微生物的基本技能，了解球菌、杆菌等在光学显微镜下的基本形

态特征。

3.学习细菌染色的原理和方法。

4.掌握细菌的简单染色法和革兰氏染色法。

5.巩固平板划线分离法及无菌操作技术。

1.2实验原理

1.2.1显微镜的使用

在普通显微镜（图1）通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物研究最

为重要，与其它物镜相比，油镜的使用方法比较特殊，需要在载玻片和物镜间加滴镜油（通

常用香柏油），这主要有以下两方面的原因：①增加照明亮度从承载标本的玻片透过来的

光线，因介质密度不同，有些光线会因折射或全反射不能进入镜头，致使摄入光线较少，物

象显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时必须在油镜和玻片之间加入

与玻璃的折射率（ｎ＝1.55）相仿的镜油（通常用香柏油，其折射率ｎ＝1.52）。光线通过

载玻片可直接通过香柏油进入物镜而几乎不发生折射（接物镜油浸系），使视野增加进光量，

这样就能使物像更加清晰。详见图2②增加显微镜的分辨率

图1图2

1.2.2革兰氏染色法

简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一

般形状和细菌排列的观察。革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰

氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌

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普通光学显微镜的使用及革兰氏染色法

学上最常用的鉴别染色法。

革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇

(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细

菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，该

菌属于革兰氏阴性菌。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结

构和组成的差异所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层

较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的

结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁

中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通

透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色

2材料与方法

2.1材料

2.1.1菌种

大肠杆菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，枯

草杆菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。

2.1.2溶液和试剂

香柏油，二甲苯，革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式碘液，95％乙醇，番红复染液等。

2.1.3仪器和其他用品

酒精灯，载玻片，普通光学显微镜，擦镜纸，接种环，试管架，镊子，载玻片夹子，载玻片

支架，滤纸，滴管和无菌生理盐水等。

2.2方法与步骤

2.2.1简单染色实验步骤

步内容备注

骤

1涂片：取一块载玻片，滴一滴馏水于波片中央，用接载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏

种环以无菌操作从大肠杆菌斜面上挑取少许菌苔于水和取菌不宜过多；涂片要涂

水滴中，混匀并涂成薄膜。均匀，不宜过厚。

2干燥：在酒精灯火焰上方文火烘干。