分子生物学 第6章-核酸分子杂交.pptx

核酸分子杂交第六章Nucleicacidhybridization2024/6/1620:501

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指含有一部分互补序列、分子来源不同的核苷酸单链，在一定条件下按照碱基互补配对的原则，形成核苷酸双链的过程。核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)印迹(blotting)指利用各种物理方法，使电泳凝胶中的生物大分子转移到硝基纤维膜等特定的支持物上，使之成为固相化分子的过程。2024/6/1620:503核酸杂交技术的理论基础：DNA变性复性现象。

第一节核酸探针及其标记核酸探针(probe)的概念：用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA或RNA的标记互补片段：与待测特定核苷酸的某一段序列互补；有明确的标志用于后续的检测。2024/6/1620:504

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探针的种类寡核苷酸探针基因组DNA探针cDNA探针RNA探针一探针的种类及其选择DNA探针2024/6/1620:506

1．基因组DNA探针双链探针:单链探针采用PCR技术将各种克隆在质粒载体中的特异性基因片段扩增、标记制备而成。用化学法合成或从克隆在M13噬菌体的特异性基因片段制备。2024/6/1620:5072．cDNA探针提取mRNA，经反转录cDNA，再经cDNA克隆或PCR扩增、标记而制备成cDNA探针。

3．RNA探针通常采用含T7或SP6启动子的表达载体来制备高度敏感的RNA探针。2024/6/1620:508将目的基因克隆到含T7或SP6启动子的表达载体的MCS中，用适当的内切酶在插入序列的下游切割而成的线性载体作为模板，加入T7或SP6RNA聚合酶、NTPs、和标记-dUTP,即可制备出高度敏感的RNA探针。4．寡核苷酸探针采用DNA合成仪人工合成、标记制备。

二核酸标记物及其选择核酸探针的标记可分为放射性标记和非放射性标记；根据标记物掺入情况可分为均匀标记和末端标记探针。不影响碱基对特异性理想标记物应备条件①高度灵敏性④有较高的化学稳定性②高度特异性检且不影响与目标DNA结合③不影响标记用酶的活性⑤标记及检测方法简单⑥环保，无损害2024/6/1620:509

优点缺点灵敏度和特异性极高半衰期短,随用随标(一)放射性核素对各种酶促反应无任何影响不影响碱基配对的特异性与稳定性放射性污染用于核酸探针标记的放射性核素主要有32P、35S和3H等；32P应用最多。2024/6/1620:5010

(二)非放射性标记物优点缺点灵敏度较放射性核素标记略低无放射性污染用于核酸探针标记的非放射性标记物主要有生物素、地高辛、荧光素(FITC、罗丹明)和酶等。稳定性好,可较长时间存放特异性较放射性核素标记低2024/6/1620:5011

2024/6/1620:5012ThemethodusedtoproducenonradioactiveDNAmoleculescarriedaspecificchemicalmarkercouldbedetectedwithanappropriateantibodyoravidin.biotin-avidinsystemDig-dUTP1.地高辛和生物素

用一种标记核苷酸代替原料dNTPs中对应的非标记核苷酸，使标记核苷酸掺入到合成新链中。Dig-dUTPUU

别名：VitaminH分子量：244.31水溶性好关于生物素（Biotin）结合对象：亲和素Avidin链亲和素Streptavidin中性亲和素NeutrAvidin单体亲和素MonoAvidin2024/6/1620:5014

当双链DNA一条链上有切口时，E.coliDNA聚合酶Ⅰ的5’→3’的外切酶活性能从切口的5’端除去核苷酸；同时，5’→3’聚合酶活性可将核苷酸连接到切口的3’羟基末端；使切口沿着DNA链移动。(一)DNA切口平移(nicktranslation)标记法2024/6/1620:5015三、核酸探针标记的主要方法用一种标记核苷酸代替原料dNTPs中对应的非标记核苷酸，使标记核苷酸掺入到合成新链中。思考题13’5’3’5’3’5’①5’→3’聚合酶活性②3’→5’外切酶活性③5’→3’外切酶活性

DNA酶Ⅰ：在双链DNA上随机打开若干个单链缺口，产生3’-OH端。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ：5’→3’DNA聚合酶活性；5’→3’外切核酸酶活性。DNA切口平移标记法示意图2024/6/