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;时间：周三
地点：309室
实验：上午1.PCR产物纯化回收（分组操作）
2.酶切（分组操作）
3.电泳
4.切胶回收
下午1.连接
2.转化（分组操作）;时间：周四
地点：309室
实验：下午：质粒提取（分组操作）
酶切电泳（略）
;;;;目的
①分离获得某一感兴趣的基因或DNA
②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）;重组;以
质
粒
为
载
体
的
DNA
克
隆
过
程;载体;载体的特点;载体种类
;质粒(plasmid);;;;目的基因的获取;mRNA;聚合酶链反应
PolymeraseChainReaction
以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3′末端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。这一过程成为PCR。;模板DNA
特异性引物
耐热DNA聚合酶（Taq酶）
dNTPs
Mg2+;;PCR的基本反应步骤;5?;Cycle3;;mRNA提取;凝胶中回收PCR产物;质粒的提取;以构建pBSK-Akt1-WT重组体为例;引物a(划线部分为HindⅢ酶切位点)：
5′-GCGAAGCTTCCATGAACGACGTAGCCATTGT-3′
引物b(划线部分为BamHI酶切位点)：
5′-ATTGGATCCTCAGGCTGTGCCACTGGCTGAG-3′;PCR产物末端限制酶切位点的切断情况;10×PCR反应缓冲液5.0?l
dNTPmix(2mmol/L)4.0?l
ExTaqDNA聚合酶(5U/?l)0.25?l
引物a(10pmol/?l)2.0?l
引物b(10pmol/?l)2.0?l
pCIS2-Akt15ng
加水至50?l
;电泳检测PCR结果;PCR产物的回收和鉴定;;电泳检测回收的PCR产物;二、PCR产物和表达载体的限制性内切酶酶切;2、限制酶操作时应注意的原则：;PCR产物(或pBluescriptII/SK)12μl
10×Y+/Tanqo（withBSA）2μl
HindⅢ(10U/?l)1.5μl
BamHI(10U/?l)1.5μl
补水至20μl
;三、PCR产物与载体的连接;四、重组体导入受体细胞;;真核细胞转染的方法;转化步骤：;五、重组体的筛选与鉴定;1、筛选阳性菌落并扩大培养：;2、碱裂解法提取质粒DNA：;试剂：;步骤：;4℃，12000g离心，5-10min，取上清移至另一Ep管中；
加入等体积的酚/氯仿抽提，振荡混匀，4℃，12000g离心2min，取上清移至另一Ep管中；
用2倍体积的乙醇，振荡混匀，室温放置2分钟；
12000g，4℃离心5分钟；
弃上清，加入1ml70％(4℃)乙醇振荡漂洗沉淀，12000g，4℃离心2分钟；
弃上清，将Ep管倒置放在滤纸上，室温干燥沉淀；
用50?l含有无DNA酶的RNA酶(20?g/ml)的TE重新溶解核酸，温和振荡几秒钟后可进行内切酶酶切实验或贮存于－20℃;3、重组质粒酶切鉴定;;原核表达与真核表达体系;实验一、组织总RNA的提取;4.离心13000转/分，3分钟；
5.取上清液（约0.6ml）转移入新的EP管；
注意：取上清要避
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