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大肠杆菌和植物基因组DNA提

生科基彭健鹏2012141242048

1.大肠杆菌DNA提方案设计

实验目的

学习并掌握细菌基因组的提方法

提取大肠杆菌DH5α中的DNA并进行质量检测

实验概述

提DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和

蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得

到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

试验准备

实验材料：大肠杆菌DH5α菌液

实验试剂：LB液体培养基，E溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/LNaCl，

CAB/NaCl溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇

实验仪器与用具：微量移液器，低温离心机，水浴锅，eppendorf管，恒温

摇床

实验步骤

（1）将2mL培养至对数期的大肠杆菌DH5α菌液5000rpm冷冻离心10分钟

弃上清；

目的：分离大肠杆菌与其培养液。

（2）加190μLE悬浮沉淀，并加10μL10%SDS，1μL20mg/mL蛋白酶K，

混匀，37℃保温1h；

目的：裂解大肠杆菌。

（3）加30μL5mol/LNaCl，混匀；

目的：盐析。NaCl降低DNA在水中的溶解度且不破坏其结构,从而提粗的

DNA。在浓氯化钠（1-2M）溶液中，DNP的溶解度很大，RNP的溶解度很小；

在稀氯化钠（0.14M）溶液中，DNP的溶解度很小，RNP的溶解度很大；

0.14MNaCl-0.01MEDA溶解RNP，而使DNP沉淀。

（4）加30μLCAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20min；

目的：CAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与

核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓

度到一定程度（0.3mol/LNaCl）时，从溶液中沉淀。通过离心就可将CAB-核

酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CAB

溶于乙醇或异丙醇而除去。

（5）加入300μL酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提，5000rpm离心10min，

将上清液移至干净离心管；

目的：分离蛋白多糖和DNA，得到较纯的DNA，若此步得到DNA不纯，可重

复此步骤进行多次纯化。

（6）加300μL异丙醇，颠倒混合，室温下静止10min，沉淀DNA；5000rpm

离心10min，沉淀DNA，加入500μL70%乙醇，5000rpm离心10min，弃乙醇，吸

干；

目的：将DNA沉淀出，进一步用乙醇促进DNA析出水。

（7）少量用光谱仪测DNA质量，并少量跑电泳。

目的：对DNA纯度的检测。

注意事项

DNA浓度和纯度的测定方法

从提取的DNA样品中取出1μL，用E稀释到100μL，用紫外/可见分光光

度计，分别测定260nm和280nm的吸光值OD260和OD280，计算检测DNA的纯

度、浓度和产率。

(1)DNA纯度＝OD260/OD280

DNA的纯制品的OD260/OD280值为1.8，而RNA的纯制品的OD260/OD280值

为2.0。若OD260/OD280值高于1.8，那么说样品中可能有RNA的污染；若样品

中蛋白或酚的污染较严重则OD260/OD280值低于1.8。

(2)DNA浓度（ng/μL）＝OD260×50μg/mL×100倍（1OD260=50ng/μl）

(3)DNA产率（ng/·FW）＝OD260×50μg/mL×100倍×50μL/0.5（体

积/材量）

2.植物基因组DNA提

实验目的：

a)了解真核生物基因组DNA提取的一般原理；

b)掌握植物基因组DNA提取的方法和步骤。

实验原理：

c)使用液氮对植物叶片进行研磨，在保证破碎细胞的同时，会大大降低酶