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ELISA操作原理、步骤及注意事项

优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果

准确可靠的必要条件。

1标本的采取和保存

可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液、分泌物和排泄物）

等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行

测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。

大部分ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和

抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，

而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况

外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清

可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞

溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA

测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。

血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源

性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发

生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来，在5天内测

定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清

融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，

可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标

本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所

以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血

清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂（见3.2.4）。

2试剂的准备

按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸

馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的

缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与

室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保

存。

3加样

在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加

底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上

部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本

应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。

有此测定（如间接法ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规定的

稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清

标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。加酶结合物应用

液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。

4保温

在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物

后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称

为温育(incubation)，有人称之为孵育，在ELISA中似不恰当。

ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。

以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都

有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原

直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到

反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如

此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。

温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。

37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温

度。在建立ELISA方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原

抗体反应一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，

可提高反应的温度，有些试验在43℃进行，但不宜采用更高的温度。

抗原抗体反应4℃更为彻底，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过

夜，以形成最多的沉淀。但因所需时间太长，在ELISA中一般不予

采用。

保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外，一般均采

用水浴，可将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使

温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜

膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱，ELISA板

应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良