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Western Blotting试验步骤
一,组织蛋白提取
准备组织细胞裂解液:1000ulRIPA+10ulPMSF,装于1.5mlEP管中,充分混合。
注:如发现RIPA有沉淀,放室温半小时或常温水域使其溶解,若PMSF为粉剂,将其配置成100mM液体备用。
组织准备:将组织从-80℃冰箱取出,放入1.5mlEP管,用小剪刀将组织建成碎片,用研磨杵研磨/玻璃匀浆器5ml匀浆充分。加RIPA裂解液(按每20mg组织加裂解液150-200微升的量添加),研磨/匀浆5分钟(在冰浴下研磨/匀浆),冰上静止30分钟。
注:1)若用玻璃匀浆器可先加3/2的裂解液,匀充分,倒到EP管,再加剩下的裂解液,把匀浆器壁上的匀浆液充分倒出来。
将裂解后的样品10000-14000g离心3-5分钟,取上清,分装至200ulEP管(一般有约400ul的上清?)即可进行PAGE、Western和免疫印迹等操作。
二,提取液中总蛋白的测定
用BCA法测定,试剂盒:索莱宝BCA蛋白浓度测定试剂盒。
配工作液:根据标准品和样品数量,按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂
(50:1)配制成BCA工作液,充分混匀。BCA工作液室温24小时内温度。
注:BCA工作液每个孔要加入200ul,标准曲线8个孔,
稀释标准品(BSA):取10微升BSA标准品用PBS稀释至100微升(样品一般可用PBS稀释),使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按
0,2,4,6,8,12,16,20微升加到96孔板的蛋白标准品孔中,加PBS补足至20ul。
稀释样品:最好多做几个梯度,如做2倍,4倍,8倍稀释),加稀释好的样品20微升到96孔板的样品孔中。由于移液器在取小量时的误差,标准线前面的点可能不很准确,所以尽可能让样品点落在标准线1/2以后。
在各孔中加入200微升的BCA工作液,37℃放置15-30分钟。用酶标仪测
定A
562nm,
根据标准曲线计算出蛋白浓度。使用温箱孵育时,应注意防止因
水分蒸发影响检测结果。
试剂/孔123
试剂/孔
1
2
3
4
5
6
7
8
编号
标准品
0
2
4
6
8
12
16
20
PBS
20
18
16
14
12
8
4
0
工作液
200
200
200
200
200
200
200
200
样品蛋白布板:
9
9
9
4
4
4
2
2
2
11
11
11
16
16
16
18
18
18
200
200
200
200
200
200
200
200
200
试剂
试剂/ 1
2
3
4
5
6
7
8
9
编号
2倍稀释
4倍稀释
10倍稀释
样品
PBS
工作液
试
试剂/ 1
2
3
4
5
6
7
8
20
20
20
20
20
20
20
20
200
200
200
200
200
200
200
200
编号PBS工作液注:测蛋白浓度过程中,可将剩下的蛋白样品存放于4℃。待浓度测完,可拿一部分蛋白样品分装,5×SDS缓冲液,于沸水中煮5-10min使蛋白变性(也可以使用PCR仪进行变性,99℃,3-5min)。此处需确定待加入5×SDS的量。计算含20-50ug蛋白样品的溶液体积即为上样量。先根据所算出来的蛋白浓度确定含20-50ug蛋白样品的溶液体积,再按蛋白样品:5×SDS上样缓冲液=4:1(此时5×SDS的浓度为1×)的比例算出5×SDS
编号
PBS
工作液
三,SDS电泳
制胶(分离胶8%,浓缩胶4%)(见附表)
清洗玻璃板,晾干备用。(洗衣粉-自来水-蒸馏水,至不挂水珠为止)
灌胶:在光线明亮处,装好垂直电泳槽模具,检验玻璃板不漏胶(可先灌进去一点分离胶,稍等片刻,观察其是否漏),用1ml移液器在玻璃板夹层中沿玻璃板一角缓慢添加分离胶(5ml),至玻璃板中上部,需缓慢进行,以确保玻璃板中无气泡产生。灌完分离胶后往玻璃板中继续添加超纯水,使制胶版完全被超纯水封闭。静置45min(20-30min?),直至在超纯水与分离胶交界处肉眼可见一条明显的折射线。将制胶版略微倾斜,用移液器吸出超纯水,并用吸纸吸去制胶版板壁上残留的水滴。用1ml移液器在制胶版右角上缓慢添加4%浓缩胶(2-3ml)至制胶版被完全封闭。将梳子垂直插入制胶版浓缩胶中,用移液器向梳子缝隙中缓慢加入浓缩胶,至空隙被完全填满。室温静置约50min,直至在浓缩胶与分离胶交界处肉眼可见一条明显的折射线,将梳子缓慢垂直取出并将制胶版用电泳夹夹好放入电泳槽。
加足够的电泳液(加至淹没内面玻
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