利用荧光显微技术研究生物单分子市公开课金奖市赛课一等奖课件.pptx

利用荧光显微技术硕士物单分子陈浩25023分析化学专业第1页第1页

光学单分子办法进展

近20年来,光学探测办法有了长足进步。在80年代出现并逐步成熟起来近场显微术为超衍射极限分辨成像提供了基本手段,同时也使光学显微术进入了纳米科学领域。而共焦显微术不但突破老式光学衍射极限,并且为光学探测引入了第三维空间信息,使光学探测含有了层析能力,实现了真正空间三维成像。超短脉冲激光技术直接造成了多光子荧光显微术成功。尤其是飞秒激光激发荧光显微术,对于提取时间分辨信息是有力工具。这种荧光单分子探测及单分子光谱探测与其数据处理办法组合,形成了荧光共振能量转移探测办法。通过该办法能够取得1.5纳米～8纳米空间分辨率构像信息,达到光学办法上最高分辨率。以上近场、共焦、荧光显微术和荧光共振能量转移四种基本技术构成了当前活跃生物单分子探测光学平台。第2页第2页

MyosinV分子结构肌球蛋白是包含18个不同子类一大类蛋白分子马达，但构型上都属于二聚体，有两个显著伸出“头”，用于附着在肌球蛋白丝上，这里我们干脆称之为“腿”。第3页第3页

MyosinV两种运动模型(1)在Hand-over-hand模型中，后腿向前移动了74nm，而前腿没有移动。分子本身移动了37nm，染料移动了37±2xnm，(假如MyosinV结构是不对称，x为染料到轴平均距离)。(2)在inchworm模型中，myosin分子所有部份都向前移动37nm，并且有一个头始终与肌球蛋白丝结合在一起。第4页第4页

单分子荧光技术检测运动模型把一个荧光分子标识在myosinV一条腿上，再用荧光显微镜来对标识荧光分子进行检测。据此来研究myosinV迈步过程。详细检测技术：全内反射荧光显微＋共聚焦荧光显微第5页第5页

远场和近场光学检测积极或被动发光原因是物体受激发之后,内部电偶极跃迁引起电磁场辐射,电磁波从物体表面向自由空间传播。物体表面以外场分布能够划分为两个区域:距物体表面仅几种波长内区域,这一区域称为近场区域;近场区域以外到无穷远是远场区。常规激发和搜集均处于远场区域。在远场区域只存在能够向无穷远传播远场波(也称为辐射波)。近场区域光场包括了限于表面仅几种波长内存在成份,即近场波(也称为非辐射波);又包括远场波。近场波也被称为衰逝波,(隐失波),其强度随离开表面距离指数衰减,不能在自由空间存在。近场波表达了光在传播过程中,碰到空间光学性质不连续时,光波空间瞬态改变,这种改变不久在空间衰减,它反应了空间光学性质不连续性。第6页第6页

全内反射显微光在光密介质中传播,假如它以不小于临界角角度入射到另一个折射率较小介质上,光就会发生全反射。。事实上,即使当角度Hc,仍然会有一小部分能量以隐失波形式穿透到液体介质中,在“近场”情况下,光沿平行界面传播。由全内反射产生近场激发照明之后,利用共焦或宽场去取像,即构成荧光标识全内反射荧光显微镜。全内反射显微术典型垂直照明深度100nm。这样薄光学层析层切片意味着信噪比比共焦系统好得多,细胞光损伤和光漂白也很小。其图像是通过CCD相机来捕获。这种仪器很灵敏或成像速度不久(但很少有CCD相机兼有以上两个长处),当前可达到量子产率已到～80%,成像速率～200帧/秒。第7页第7页

共聚焦显微在光学成像系统中利用两个焦点来生成物体象。一个焦点为使用显微镜物镜把入射激光在物体表面或内部形成。这个焦点便是一个象点，也是一个点光源。它能够是反射光，也能够是物体受激发发出荧光。这一象点再通过另一个物镜成像在针孔孔径上，则生成了第二个焦点。这两个焦点是共轭（共焦）。通过沿x或y方向一点点地生成象点，综合成平面图像，再调整z方向生成象点，通过计算机合成三维图像。因此共焦显微镜含有对细胞和光漂白区域进行深度三维成像能力。第8页第8页

Hand-over-handVSinchworm纳米精度荧光成像技术FIONAFluorescenceimagingwithone-nanometeraccuracyinchworm模型预测每步长度应当是37nm，分子本身移动也是37nm；而hand-over-hand模型观测长度应当是分子本身移动位移两倍――也就是74nm。为了测试这两个运动模型，科学家开发了一个单荧光分子成像技术来定位，误差能够小于1.5nm，并含有0.5秒时间分辨率。同时能够拍摄几分钟影像来观测。全内反射荧光显微(TIRF)用来激发多个单个荧光分子，并使用CCD来拍摄帧逐帧连续图像（不存在帧间失效时间）。单纳米准确荧光成像(FIONA)技术比使用其它办法在常温下对单荧光分子定位准确度提升了20倍，在成像能力上提升了10倍。Probes:RBor