高效液相色谱仪的原理及应用.ppt

**内容与书不一样，以课堂为准（书上几个组成没总结，以防只看书就能考好）**气相色谱需要泵吗？输液系统的功能:◆提供足够的驱动力使流动相通过填充柱◆使流动相流量精确和稳定◆使流动相组成精确**在HPLC中应用最多的是往复泵，这种泵使用带有往复活塞小体积泵室(35～345μL)。流速不稳－保留时间定性？**气体－高压溶解－低压析出（啤酒、可乐…)**这个要注意，书上没有！**时间长、浪费溶剂**----一开始就用纯甲醇去洗，会怎么样？**IC会再讲。提问：如何增加进样量？（加大长度、内径）有的同学说加快流速、有用吗？**柱跟人一样也有幼年、青年、老年期…老化、活化…直型不锈钢管，内径1～8mm，柱长5～40cm。液－液：肥皂表面的水，。。。以前是象涂油漆一样把固定液直接涂上去，很容易流失；后来发展出化学键合的方法，固定液就象是生了根的，怎么冲都冲不掉的。**通常，化学键合相的载体主要是硅胶（表面有硅醇基）。通过化学反应把各种不同的有机基团键合到载体表面，代替机械涂渍的液体固定相。这不仅避免了液体固定相流失的困扰，还大大改善了固定相的功能，提高了分离的选择性，化学键合色谱适用于分离几乎所有类型的化合物。**100米跑，拉终点线，太高检查不到有人（有东西出来却没峰…)目前常用的检测器主要有：紫外-可见检测器荧光检测器电化学检测器折光示差检测器蒸发光散射检测器质谱检测器?紫外吸收检测器是目前HPLC中应用最广泛的检测器。它灵敏度高，线性范围宽，对流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱，它要求被检测样品组分有紫外吸收，使用的洗脱液无紫外吸收或紫外吸收波长与被测组分紫外吸收波长不同，在被测组分吸收波长处没有吸收。**本质仍为紫外吸收检测器，一次一个波长一次许多个波长**荧光检测器是一种专用型检测器，灵敏度在目前常用的HPLC检测器中最高，在HPLC中应用较多。仅次于紫外吸收检测器。它用于能激发荧光的化合物。很多与生命科学有关的物质，如氨基酸、胺类、维生素、甾族化合物及某些代谢药物都可以用荧光法检测。荧光检测器在生物样品痕量分析中很有用，尤其在用荧光衍生剂后，可以检测很微量的氨基酸和肽。**m/eHPLC-紫外尚可狡辩HPLC-MS…**一定的色谱系统和操作条件下，每种物质都有一定的保留时间，如果在相同色谱条件下，未知物的保留时间与标准物质相同，则可初步认为它们为同一物质。为了提高定性分析的可靠性，还可进一步改变色谱条件（分离柱、流动相、柱温等）或在样品中添加标准物质，如果被测物的保留时间仍然与标准物质一致，则可认为它们为同一物质。跑100米，只允许你跑10秒，别人就不能跑10秒？同一个人，赛道、天气不同成绩也不同。**依据:被测物质的量W与它在色谱图上的峰面积A（或峰高）成正比。——响应的程度、敏感度。因为峰高比峰面积更容易受分析条件波动的影响，且峰高标准曲线的线性范围也较峰面积的窄，因此，通常情况是采用峰面积进行定量分析。峰面积比峰高更稳定：峰高一维，S二维，H偏一点，宽度可以补回去。组分的峰面积越大,所占比例越大?——画图说明，紫外，虽然在柱子上分开了，但在检测器上未必检测得出来。剪纸测峰面积**绝对校正因子受实验条件的影响，定量分析时必须与实际样品在相同条件下测定标准物质的校正因子。人不能两次踏进同一条河里：样品不能两次经过同一根色谱柱。假设电压变低、柱效下降、时间增加（画图），使峰面积减少10％，则算出来的fi减小。怎么消除呢？相对f。**S作为参照物。不同色谱仪之间互相比较….选择的标准物质S可以另外进样，单独作一个色谱图；也可以加入试样中和待测样一起出图——内标法：如假设电压变低，峰面积都减少10％，则fi?仍＝…=原。**画图、板书说明。如假设手一抖没按到底，峰面积都减少10％，则fi?仍＝…0.9Ai/0.9As=原。内标法是精度最高的色谱定量方法。100米跑，同1个人，不同跑道（柱）…；同1跑道，有风无风，跑道橡胶磨损…不一样：与…一起跑…内标法是在分析样品之前将已知浓度的标准物质（内标物）加入到未知样品中去，然后比较内标物和被测组分的峰面积，从而确定被测组分的浓度。由于内标物和被测组分处在同一基体中，因此可以消除基体带来的干扰。而且当仪器参数和洗脱条件发生变化时，内标物和样品组分都会受到