实验 DNA片段的扩增及电泳鉴定课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3.pptxVIP

1.目的基因的筛选和获取-前提利用PCR获取和扩增化学方法人工合成2.构建基因表达载体-核心目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞-关键农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物)、感受态细胞转化法(微生物);4.目的基因的检测与鉴定-保证分子检测：是否插入、转录、翻译个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。基因工程的基本操作程序（4个步骤）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。目的：确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。前情回顾

核心步骤基因工程的基本操作程序前情回顾基因表达载体的构建过程载体（质粒）DNA分子（含目的基因）带有黏性末端或平末端的切口目的基因片段DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）相同限制酶终止子：终止转录标记基因：便于重组DNA分子的筛选和鉴定。启动子：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。

构建表达载体导入农杆菌导入植物细胞新性状植株农杆菌转化法操作程序目的基因导入植物细胞--植物组织培养Ti-DNA将目的基因插入植物细胞染色体DNA将目的基因插入到Ti质粒上的T-DNA中基因工程的基本操作程序（4个步骤）前情回顾

目的基因的检测内容及方法：类型检测内容方法分子水平的检测个体生物学水平的鉴定受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因目的基因是否转录出了mRNAPCR，分子杂交等技术目的基因是否翻译成蛋白质抗原-抗体杂交技术个体是否具有相应性状抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等基因工程的基本操作程序前情回顾

琼脂糖凝胶电泳思考：如何对PCR扩增的产物进行鉴定？

第4课时第一章实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定

学习目标1、掌握DNA片段的扩增及电泳鉴定的原理2、了解PCR技术和琼脂糖凝胶电泳的过程

自学指导：阅读P84-85，限时4分钟1.实验原理：①利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理②DNA片段电泳鉴定的原理2.实验材料用具3.操作步骤（结合课时练P91页）①DNA片段的扩增②DNA片段的电泳鉴定4.注意事项

探究?实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定1.实验原理①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环；②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理；（1）DNA体外扩增的原理

①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳；②PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定；③在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关（迁移速率与之呈负相关）④凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。（2）DNA片段电泳鉴定的原理

凝胶电泳原理示意图

1.仪器2.材料PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪电泳槽等）4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、DNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等微量离心管微量移液器PCR仪

10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量为1pg-1μg）5～10μL总体积50μL3.PCR反应体系的配方

4、实验步骤（PCR）用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。（提高反应速率）参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。移液离心扩增预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。

根据待分离DNA片段的大小，用_______配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的________混匀。将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成。配制琼脂糖溶液制备琼脂糖凝胶核酸染料加样孔电泳缓冲液梳子孔为加样孔，加样孔侧连电极负极。4、实验步骤（电泳鉴定）

根据待分离DNA片段的大小，用_______配制琼脂糖溶液