核酸分子杂交与应用描述课件.pptVIP

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核酸分子杂交：来源相同或不同的DNA甚至DNA与RNA分子变性后，在合适的条件下通过碱基互补形成双链杂交体的过程称核酸分子杂交(molecularhybridization)。核酸分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，也是临床分子检验的重要技术。6/18/20242

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核酸分子杂交的基本原理与分类核酸分子杂交的基本原理：DNA分子由两条互补的单链形成的双螺旋结构。维持结构稳定的力有三：1、两条链间互补碱基的氢键；2、碱基间的堆积力(范德华力)；3、中和链内的负电荷。变性：在理化因素作用下，双螺旋结构间的氢键断裂，两条链解开形成单链的过程。6/18/20244

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变性温度(Tm)：核酸分子热变性时，从开始变性到变性结束，是在一个很窄的温度范围内进行的，当变性进行到核酸分子解链一半时的温度，称变性温度，也称融解温度。6/18/20246

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影响变性的因素：1、碱基组成DNA分子中G＋C含量越高Tm越高。在1×SSC溶液中，两者之间的关系可以用经验公式表示：Tm＝(G+C)%×0.41+69.3其中，69.3为无G＋C存在时的Tm值。(G+C)%每增加1％，Tm约上升0.41C。o6/18/20248

影响变性的因素：2、溶液的离子强度DNA链骨架上的磷酸基团带有较多的负电荷，它们之间的静电相斥作用是其双链的不稳定因素之一。在无盐的水中，DNA在室温下就会变性，加入盐后，正离子可以封闭磷酸基团的负电荷，使DNA稳定性增加，Tm值升高。6/18/20249

影响变性的因素：3、pH值pH值在5～9范围内，Tm值变化不明显。在高pH值下，可使碱基失去形成氢键的能力。当pH大于11.3时所有氢键均被破坏，DNA完全变性。4、变性剂可以干扰碱基堆积力和氢键的形成，因此可以降低Tm值。常用的变性剂是甲酰胺和脲，通常用50％的甲酰胺以使Tm值降低30oC。6/18/202410

复性：变性核酸分子在合适的条件下重新形成双螺旋结构的过程称复性。热变性的DNA溶液在低于Tm值25Co的温度下维持相当长的一段时间，则可使之恢复到天然的双链结构状态。复性的速度受以下因素影响：1、DNA浓度DNA浓度越大复性速度越快；2、DNA的分子质量大分子质量的DNA扩散速度慢，复性速度慢；6/18/202411

3、温度温度过高，有利于DNA变性而不利于复性；4、离子强度5、DNA分子的复杂性DNA总量一定时，基因组越复杂，其中特定顺序的拷贝数越少，互补顺序的浓度越低，复性反应速度越慢。6/18/202412

分子杂交技术就是利用了核酸分子的变性与复性原理，使变性的核酸分子与检测核酸分子在碱基互补的条件下形成杂交双螺旋的过程。探针(probe)：在核酸变性实验中，为使杂交体与单链核酸分子区分开来所使用的带有标记的单链核酸分子。6/18/202413

核酸分子杂交分类：以杂交分子分类：DNA与DNA杂交；DNA与RNA杂交；RNA与RNA杂交。以探针标记分类：以杂交介质分类：液相杂交与固相杂交。液相杂交：菌落杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、原位杂交及基因芯片等技术。6/18/202414

液相杂交(solutionhybridization)：是一种比较原始的分子杂交技术。待测分子与探针在杂交液中完成反应，利用层析方法将杂交分子与末杂交分子分开后用液闪仪进行计数或利用紫外吸收特性变化分析杂交结果的分子杂交类型。液相杂交又分为：RNA酶保护分析法、核酸酶S1保护分析法。6/18/202415

RNA酶保护分析法(RPA)：利用RNaseA和RNaseT1能专一性降解单链RNA而双链RNA受到保护的特点，用体外转录合成的放射性标记的RNA探针与待检mRNA进行液相杂交，使互补序列RNA探针和待测RNA形成杂交体，用RNase降解非杂交部分RNA后分析杂交结果。6/18/202416

RNA酶保护分析法的应用：mRNA定量mRNA未端定位内含子在相应基因中的位置6/18/202417

RNA酶保护分析法的主要步骤：1、制备待测RNA从细胞或组织中提取总RNA或mRNA；2、RNA探针标记采用体外转录的方法制备和标记探针；3、分子杂交：将待测样品RNA和RNA探针在液相中杂交，杂交前将样品和探针变性，破坏二级结构；4、RNA酶消化单链RNA；5、电泳分析杂交分子。6/18/202418

核酸酶S1保护分析法(nucleaseS1protectionassay)：原理与RNA酶保护分析法的原理类似，核酸酶S1能专一性地降解单链DNA和RNA，而不能降解DNA/RNA杂交双链。采用M13体系克隆和扩增特定基