基因工程与食品产业.ppt

二、基因工程载体定义：是指能有效地运载外源DNA片段进入受体细胞内的可自主复制的DNA片段。即载体和外源DNA在体外组成重组DNA分子，进入受体细胞后能进行自我复制。载体决定了外源基因的复制、扩增、传代乃至表达。基因工程载体一般需具有以下特点:①在宿主细胞中能够独立自主地复制；②容易从宿主细胞中分离纯化；③载体DNA分子中有一段非必需区域，插在该区域的外源基因可以像载体的正常组分一样进行复制和扩增；④具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记⑤具有很强的启动子、阻遏子和终止子。基因工程中常用的载体主要有：①质粒（plasmid）载体;

②噬菌体载体；

③病毒载体；

④上述载体相互组合或与其他基因组DNA组合成的载体。这些载体可分为克隆载体和表达载体，其中表达载体又分胞内表达和分泌表达两种。根据载体进入的受体细胞不同，又分为原核细胞和真核细胞表达载体。在基因工程操作中，根据运载的目的DNA片段大小和宿主需要选用合适的载体。（一）质粒(plasmid)载体质粒是常用的克隆载体，广泛存在于包括细菌、酵母在内的多种微生物中，在宿主细胞的染色体外以稳定的方式遗传。它是一种双链环状的DNA分子。独立地自我复制及转录。质粒◆质粒(plasmid)是细菌染色体外存在的一种能够自我复制的双链闭合环状DNA分子，大小1kb～200kb。质粒常常带有一些特殊的基因，如致死基因，抗抗生素的基因等等。一般质粒都含有一个复制起始区，可独立复制。质粒DNA复制与宿主之间的关系，可分为“严谨型”和“松弛型”。“严谨型”质粒在每个细胞中的拷贝数通常1~3个，而“松弛型”通常在10个以上，可高达200个拷贝。◆一般质粒通过改造后才能用于遗传工程。①分子量小，稳定存在，较高拷贝数；②有遗传标志;③内切酶位点。质粒分为多种类型：F质粒R质粒降解质粒作为克隆载体的质粒应具备以下特点:1.质粒载体pBR322长度为4.3kb，含有氨苄青霉素和四环素的抗性基因(Ampr和Tetr)。在氨苄青霉素和四环素的抗性基因中间有限制性内切酶位点，便于外源基因的插入和筛选。有一个复制的起始位点，保证只在E.coli中复制。基因工程载体质粒载体酶切图谱示意图2质粒载体pUC19pUC系列质粒，全长2.6kb，由pBR322的氨苄青霉素抗性基因、复制起始位点以及大肠杆菌lacZ基因片段构成，在lacZ基因中加入了多克隆位点，供外源基因的插入，可以进行颜色筛选。3酵母质粒载体4农杆菌质粒载体土壤农杆菌Ti质粒：通过感染植物的伤口，诱发伤口组织形成冠瘿瘤，同时在瘤内合成冠瘿碱。Ti质粒有4个区：T-DNA转移区vir区，毒性区细菌吸收利用冠瘿碱区其他区域农杆菌质粒载体

（二）噬菌体载体噬菌体是侵染细菌的病毒。用做克隆载体的噬菌体有两种:λ噬菌体,M13噬菌体。λ噬菌体是线状双链分子，是温和噬菌体。进入大肠杆菌后即通过粘性末端的碱基配对形成环状分子，也可以整合进入宿主细胞基因组中。在某种营养条件或环境协迫时进入裂解循环。噬菌体载体非必需基因在基因组中，接近40%的区域是非必需的，可以将这部分切除，在此区域插入外源DNA片段。λDNA可以作为载体，通过替换自身序列的方式携带外源DNA。λ噬菌体的基因组必需基因头尾第三节基因工程的基本技术目的基因的获得与序列分析目的基因序列与载体的连接，制成DNA重组体将DNA重组体导入宿主细胞目的基因序列克隆的筛选与鉴定1．从生物体的基因组中分离目的DNA序列。包括DNA的纯化技术，酶促消化或机械切割，以游离目的DNA序列。2．建立人工的重组DNA分子，即将目的基因插入一能在宿主细胞中复制的DNA分子，即克隆载体。3．将重组DNA分子转到合适的宿主中，如大肠杆菌。4．利用细胞培养技术，培养筛选转化的细胞。一个转化的宿主细胞能生长并产生遗传上相同的克隆细胞，每个细胞都携带着转化的目的基因，此技术就是常指的“基因克隆”或“分子克隆”。目前广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。（一）获得目的基因的方法目的基因：就是人们所需要转移或改造的基因。它含有一种或几种遗传信息的全套密码。供体生物细