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奶牛A2型β-酪蛋白基因测定PCR方法

1范围

本文件描述了奶牛A2型β-酪蛋白基因检测的PCR方法。

本文件适用于奶牛A2型β-酪蛋白基因的检测与基因型判别。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

GB/T27642牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

β-酪蛋白基因β-caseingene，CSN2gene

β-酪蛋白（caseinbeta）基因，位于牛第6号染色体上，在基因序列数据库（GenBank）中的基

因编号为281099，基因全长8522bp。CSN2基因（XM_010806178.3）包含9个外显子，编码区长度为

675bp，编码224个氨基酸。

3.2

A2型β-酪蛋白A2β-casein，A2CSN2

奶牛β-酪蛋白含有多种变体型（A1、A2、A3、B、C、D、E、F、G等）。β-酪蛋白不同变体型之

间的区别在于β-酪蛋白基因（CSN2）编码区一个或几个碱基的变化，导致相应氨基酸的改变。其中，

当CSN2基因编码区的8个SNPs位点，即c.245CA、c.259CG、c.307CA、c.322AC、c.363CA、

c.411CG、c.458CT和c.500CT，对应的基因型分别为c.245（CC)、c.259（CC）、c.307（CC）、

c.322（AA）、c.363（CC）、c.411（CC）、c.458（CC）和c.500（CC）时，其编码的蛋白称为A2型

β-酪蛋白。

3.3

A2奶牛A2DairyCattle

拥有A2型β-酪蛋白基因的奶牛。

注：简称为A2奶牛。

4原理

利用特异性PCR引物，扩增涵盖8个SNPs位点的β-酪蛋白基因片段，利用DNA测序仪对PCR产物

测序，依据8个SNP位点的基因型组合信息，确定奶牛β-酪蛋白基因的基因型，鉴定出A2奶牛。

5试剂或材料

5.1除非另有说明，仅使用分析纯试剂。所有试剂溶液均用无DNA酶和RNA酶污染的容器分装。

5.2水：GB/T6682，一级。

2+

5.310×PCR缓冲液（含Mg）。

5.4dNTP溶液（含dATP，dCTP，dGTP和dTTP各2.5mmol/L）。

5.5上游引物F。

5.6下游引物R。

5.7TaqDNA聚合酶。

5.8阳性对照样品：A2型样品基因组DNA

5.9核酸染料。

5.1050×TAE缓冲液：三羟甲基氨基甲烷242.0g，乙二胺四乙酸二钠二水合物37.2g，冰乙酸57.1

mL，定容至1L。

5.111%琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于250mL锥形瓶中，加入100mL1×TAE溶液，加热3min至

琼脂糖完全熔化。待琼脂糖溶液冷却至50℃~60℃后加入核酸染料，摇匀，向预制胶槽中灌胶。

5.12PBS缓冲液：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g和磷酸二氢钾0.24g溶于800mL

水中，用盐酸调节pH至7.4，最后用水定容至1L。

6仪器设备

6.1分析天平：感量0.001g。

6.2PCR扩增仪。

6.3DNA测序仪。

6.4电泳装置。

6.5凝胶成像分析系统。

6.6离心机：离心力不低于12,000g。

6.7恒温水浴锅：0~100℃，精度为±1℃。

7样品

7.1静脉血样

采集静脉血样2mL~5mL，注入EDTA抗凝采血管，-20℃保存，备用。

7.2组织

采集组织（耳组织等）0.1g~0.3g，浸入75%的酒精，-20℃保存，备用。

7.3毛囊

采集带毛囊的牛毛20根~30根，浸入75%的酒精或置于毛囊卡，-20℃保存，备用。

7.4精液

采集鲜精0.2mL~0.5mL或细管冷冻精液1支~2支，液氮保存，备用。

7.5生牛乳

采集新鲜生牛乳2mL~10mL，4℃离心30min；去掉上层乳脂，用吸管将中间层的乳蛋白