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1
0731蛋白质含量测定法
组成蛋白质的基本单位是氨基酸,氨基酸通过脱水缩合形成肽链,蛋白质是一条或多条
多肽链组成的生物大分子。不同品种应针对自身蛋白质特性选择适宜的测定方法并做相应方
法学验证,同时应尽可能选用与待测定品种蛋白质结构相同或相近的蛋白质作对照品。2
第一法凯氏定氮法3
本法系依据蛋白质为含氮的有机化合物,当与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化时使
蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸液吸收后以
硫酸滴定液滴定,根据酸的消耗量算出含氮量,再将含氮量乘以换算系数,即为蛋白质的含
量。
本法灵敏度较低,适用于0.2~2.0mg氮的测定。氮转化成蛋白质的换算系数因蛋白质中
所含氨基酸的结构差异会稍有区别。
供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备,生物制品按如下方法操作。
精密量取供试品(如供试品为冻干制剂或固体粉末时,应复溶后量取)适量,用0.9%氯
化钠溶液稀释并定量制成每1ml中含氮量约1mg的溶液,精密量取1ml,作为总氮供试品
溶液进行测定。非蛋白氮供试品溶液的制备,除另有规定外,照附注项下钨酸沉淀法操作,
即得。
测定法除另有规定外,按测定法(1)操作,生物制品按测定法(2)操作。
(1)本测定法适用于不含无机含氮物质及有机非蛋白质含氮物质的供试品。精密量取各
品种项下规定的供试品溶液适量,置凯氏定氮瓶中,照氮测定法(通则0704第二法)测定供
试品溶液的含氮量,除另有规定外,氮转换为蛋白质的换算系数为6.25。
1中国药典2010年版一部无蛋白质测定的附录;二部附录ⅦM中收载的蛋白质含量测定法,包括凯式定
氮法、福林酚法(Lowry法)、双缩脲法、2,2’-联喹啉-4,4’-二羧酸法(BCA法)、考马斯亮蓝法、紫外
-可见分光光度法共六种方法;三部附录ⅥB中收载的蛋白质测定法,包括凯氏定氮法、Lowry法和双缩
脲法三种方法。上海所通过对已有的蛋白质测定法的系统性、规范化研究,将中国药典2010年版二、三部
各附录的所有测定方法进行梳理规范,拟整合成统一的附录。
2关于各法测定所用蛋白对照品,为正确规范使用对照品和标准品,拟统一改为“蛋白测定用对照品”。但
是,由于二部品种与三部品种中蛋白测定用对照品的来源、适用范围等均不同,二部采用中检院对照:血
清白蛋白(牛);三部亦采用中检院对照:蛋白含量测定国家标准品;两者未统一。故拟订标准中暂未统称
为“蛋白测定用对照品”,而是将其分别标示为“血清白蛋白(牛)对照品”和“蛋白含量测定国家标准品”,
从而供不同品种分别采用,以免混淆。建议中检院统一对照品后再作修订。
3本法中国药典2010年版二部、三部均有收载,且与欧洲药典8.0版、英国药典2013年版与美国药典36
版附录中收载的方法基本一致。不同点在于:(1)二部附录对供试品溶液并未做具体规定,三部附录给出了
供试品溶液的制备方法;(2)二部附录给出非蛋白氮供试品溶液制备的两种常用方法用于非氮的测定,三部
附录采用钨酸沉淀法用于非氮的测定,采用三氯醋酸沉淀法直接测定供试品中蛋白氮的含量。二部、三部
所用这两种蛋白沉淀方法原理、操作、试液浓度均基本一致。经试验验证,整合为现有内容。
(2)本测定法适用于添加无机含氮物质及有机非蛋白质含氮物质的供试品。除另有规定
外,精密量取各品种项下规定的总氮及非蛋白氮供试品溶液适量,分别置凯氏定氮瓶中,照
氮测定法(附录VⅡD第二法)测定,以总氮量减去非蛋白氮量即为供试品溶液的含氮量,
除另有规定外,氮转换为蛋白质的换算系数为6.25。
【附注】非蛋白氮供试品溶液制备常用方法
钨酸沉淀法精密量取供试品(如供试品为冻干制剂或固体粉末时,应复溶后量取)适
量(蛋白质含量不高于0.2g),置20ml量瓶中,加水10ml,加10%钨酸钠溶液2ml,0.33mol/L
硫酸溶液2ml,加水至刻度,摇匀,静置30分钟,滤过,弃去初滤液,取续滤液,即得(可
依据蛋白质浓度适当调整10%钨酸钠溶液及0.33mol/L硫酸溶液用量,使钨酸终浓度保持1
%)。
三氯醋酸沉淀法精密量取供试品(如供试品为冻干制剂或固体粉末时,应复溶后量
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