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第16章基因诊疗王慧莲基因诊断培训讲义第1页

概述几乎全部疾病均在一定程度上与基因有某种联络，基因改变，或是疾病发生原因，或是疾病发生结果，或是疾病发生时伴随现象，而这些现象出现是有规律。所以，能够经过检测基因改变来反应疾病发生和发展，疗效和预后基因诊疗：是以DNA或RNA为诊疗材料，经过检验基因存在、缺点或表示异常，对人体状态和疾病作出诊疗方法和过程。基因诊断培训讲义第2页

基因诊疗经历了三个基本发展阶段第一阶段：２０世纪８０年代，以DNA分子杂交为基础，经过限制性片段长度多态性性（RFLP)分析进行．第二阶段：应用PCR技术．第三阶段：应用基因芯片技术．基因诊断培训讲义第3页

第一节基因诊疗基础技术一.基因诊疗中惯用几个技术（一）核酸杂交（二）PCR（三）DNA序列测定（四）DNA芯片技术基因诊断培训讲义第4页

(一)核酸分子杂交技术(1)方法:以已知次序核酸片段作为探针,经放射性或非放射性物质标识后,再与未知目标核酸片段进行杂交反应,分离已杂交和未杂交标识核酸链,经过标识信号检测就能够对未知目标核酸链进行定性、定量分析.(2)几个不一样形式核酸分子杂交a.Southern印迹(southernblot)杂交:用于DNA检测，可用于基因限制性内切酶谱分析，基因突变分析等．b.Northern印迹(Northernblot)杂交:用于RNA检测，能对组织细胞中总RNA或mRNA进行定性和定量分析．c.斑点杂交（dotblot):既能够检测DNA也能够检测RNA,用于特定基因及其表示定性和定量分析．方法简单、灵敏；但特异性低． 基因诊断培训讲义第5页

原位杂交（insituhybridization):是细胞学技术与核酸杂交技术结合一个核酸分析检测技术．可分为DNA原位杂交和RNA原位杂交,用于检测染色体中特定基因位置，用于染色体疾病诊疗．分类:①玻片原位杂交:如中期染色体和组织切片.②膜上原位杂交:将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜(如硝酸纤维膜)基因诊断培训讲义第6页

原位杂交镜像图基因诊断培训讲义第7页

(二)PCR技术在基因诊疗中应用（１）等位基因特异性寡聚核苷酸（allelespecificoligonnucleotide,ASO)探针斑点杂交：PCR-ASO该方法是诊疗已知点突变：需分别合成野生型和突变型探针．在基因诊疗时，只需用PCR扩增受检者目标DNA片段，再分别与上述探针杂交．杂交结果有以下几个情况：①PCR扩增产物与正常探针杂交，不与突变探针杂交--不存在这种突变；②只与突变探针杂交--突变基因为纯合子；③与正常探针和突变探针都可杂交--突变基因为杂合子；④与正常探针和突变探针都不能杂交--突变基因不属于已发现类型基因诊断培训讲义第8页

（２）单链构象多态性（singlestrandconformationploymorphism,SSCP)分析是一个基于单链DNA构象差异来检测点突变方

法．DNA变性形成单链，在中性条件下长度相同单

链指DNA,假如碱基组成和(或)排列次序不一样,形成

构象就不一样,这么就形成了单链构象多态性.这些分子在非变性PAGE中电泳中表现出不一样迁移率.

SSCP尤其适于分析小于400bpPCR产物。据认为SSCP能够区分1bp差异

PCR-SSCP分析不能确定基因变异内容，所以电泳后结果有差异后还需进行测序分析，确定变异性质

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(3)限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLP）分析基因突变造成基因碱基组成或(和)次序发生改变,会在基因结构中产生新限制性内切酶位点或使原有位点消失.用限制酶对不一样个体基因组进行消化时，其电泳条带数目和大小就会产生改变，依据这些改变能够判断出突变是否存在.基因诊断培训讲义第10页

限制性片段长度多态性RFLPs(restrictionfragmentlengthpolymorphisms)样品一样品二1987年,H.Donis-Keller等人以RFLP为遗传标识绘制了第一张人类遗传图谱基因诊断培训讲义第11页

(4)PCR+变性梯度凝胶电泳分析技术双链DNA在一定浓度变性剂(尿素,甲酰胺)作用下,会变性而解链,造成DNA分子电泳迁移率改变.当在不一样梯度浓度变性胶中电泳时,DNA泳动到变性剂浓度能使DNA发生变性，DNA开始解链