植物组织培养课件.ppt

第九章植物细胞、组织及器官的超低温保留;植物种质资源是植物育种的基础，种质资源的保留方式有原生境保留和非原生境保留，非原生境保留包括移地保留（种质圃或植物园保留）、种质（种子）库保留、离体保留等。其中种质资源的离体自20世纪60年代逐渐得到广泛应用。

种质资源的离体保留是对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等材料，采用限制生长、延缓或停止其生长的处理使之保留，在需要时可以重新恢复其生长，并再生植株的措施。

离体保留又分为限制生长保留和超低温保留。;限制生长保留是运用限制离体培养物的生长速度来保留种质的措施，是离体保留的常用措施。限制离体培养物生长速度的措施重要有：

（1）低温保留法

（2）高渗透压保留法

（3）生长克制剂保留法

（4）减少氧分压保留法

（5）干燥保留法

而超低温保留是将要保留的材料通过合适处理后，保留在液氮中（-196℃），植物细胞生长停止，但细胞活力和形态发生潜能得到了保留。;1949年Polge发现甘油具有保留特性，标志着低温生物学的形成；

1980年开始进行玻璃化保留，开展超低温保留研究。

动物细胞、组织、胚胎---植物细胞、组织、器官;保持细胞培养物的遗传稳定性；

2.长期保留植物的种质资源;

长期保留农作物的优良品种及其育种亲本材料的种质；

建立长期保留的茎尖分生组织种质库及无病毒的原种；

5.保留试验材料，防止再培养中遗传变异。;在低于-700C的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。因此采用合适的措施将生物材料降至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以合适的措施将冻存的生物材料恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。;所谓冷冻保留，就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-700C的超低温条件），并在此温度下对其长期保留的过程。

而复苏就是以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。不管是微生物、动物细胞、植物细胞还是??外培养的器官都可以进行冻存，并在合适条件下复苏。;水在低于零度的条件下会结冰。假如将细胞悬浮在纯水中，伴随温度的减少，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会导致细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶损伤。;假如将细胞悬浮在溶液中，伴随温度的减少，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。假如将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，导致细胞死亡。这种因保留溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。;当温度深入下降，细胞内外都结冰，产生冰晶损伤。不过假如在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。由于冷冻保护剂轻易同溶液中的水分子结合，从而减少冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度减少未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保留。;在复苏时，一般以很快的速度升温，1-2分钟内即恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的构造和功能。冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。并且不一样的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样样。;1.重要仪器设备

(1)用于组织和细胞培养的全套设备；

(2)一般电冰箱；

(3)-70℃--80℃的低温冰箱；

(4)程序降温器；;(5)玻璃或塑料试管（5ml或10m1），封盖严密，不进液氮；

(6)液氮;

(7)光学显微镜和紫外荧光显微镜；

(8)分光光度计。

;;;2.基本程序

(1)材料的准备与选择。

(2)预处理。

(3)将材料装入试管，并随即插入冰浴中。

(4)加入0℃预冷的冰保护剂，在0℃(冰浴中)放置30一45分钟。

(5)降温冰冻。;(6)保留后的化冻：一般在37—40℃温水浴中迅速化冻。

(7)活力测定,一般采用TTC法(氯化三苯四氮唑还原法)。假如是单细胞或原生质体，可采用活性荧光素染色法，显示活细胞，记录存活率。

(8)再培养，观测组织细胞恢复生长的速度、存活率、植株的再生能力。

(9)遗传性状的分析：如植株的形态特性、生长发育状况、染色体、同工酶及抗逆性等。;