激光扫描共聚焦显微镜.ppt

激光扫描

共聚焦显微镜;简介;激光扫描共聚焦显微镜;共聚焦显微镜基本知识;荧光和荧光显微镜;二、荧光显微镜术的基本原理;老式显微镜的缺憾;对于有一定厚度的样品（不小于2微米）物镜聚焦平面的上下也有光被激发，焦平面上的荧光图象将有一定的模糊，这被称为轴向(Z)干扰

另首先，样品也会受到同一焦平面上的临近区域所激发荧光的干扰，使得图象对比度减少，这被称为侧向（XY）干扰;荧光显微镜;共聚焦显微镜的优势;与老式显微镜的原理差异;共聚焦显微镜发展历史;激光扫描共聚焦显微镜发展至今，已经不再是一般的光学显微镜，而是汇领先的激光技术，显微镜技术，光度技术，计算机及图象处理技术等多种高技术于一身的大型仪器，是当今世界上最先进的荧光成像和细胞分析手段之一;激光扫描共聚焦显微镜的基本构造;系统构成;倒置荧光显微镜;激光器;扫描器;;系统控制塔;荧光显微镜系统及样品台;什么是“激光扫描共聚焦显微镜”？;共焦显微镜有高辨别率;激光扫描共聚焦显微镜的工作原理;检测针孔光栏;光源;物镜;荧光显微镜;;激光共焦扫描系统的长处;X;XYZimages;二、功能及其应用;采集和处理图像;;成像特点如下;〔2〕采集多重荧光分解及合成图像。对多重荧光标识的样品，即可采集各单色荧光独立的共焦图像，又可获取多荧光的和成图像，并且运用次序扫描程序及光谱分析技术克服各通道光谱交叉干扰。;〔3〕所采集的荧光图像比一般的荧光显微镜质量好，更利于观测，高敏捷的光电倍增管，高度精确的扫描系统和光路设计，先进的图像处理软件，使其可以对样品中很弱或很强的荧光信号进行增强或减弱，去噪，平滑，提取等操作，从而保证了图像高反差，高清晰度，定位精确。;;〔4〕可以选择样品中感爱好的区域和深度进行扫描。在获取样品共焦图像过程中，可根据试验目的选择采集图像的区域，确定CT式扫描的起点，终点，深度，步距和光切片的数量，最佳的辨别率，图像的放大倍数等，并测量每幅光切片在样品中的空间位置。;〔5〕获取三维重建图像：运用先进的计算机软件，对CT式扫描所获得的各层面持续光切片进行三维重建，从而实现对样??三维构造的直接观测，空间定位，定量测定荧光强度和空间距离。;;;荧光分子的定性及定位

;常见的定位措施有

;〔2〕多重荧光标识共定位

为了检测两种以上不一样成分，就要使不一样的待测成分具有不一样的光谱特性，包括具有不一样的荧光发射波长，发射光谱，激发光谱，最大激发波长等。可运用不一样的荧光探针标识不一样成分来实现，通过共焦图像，可以显示出不一样荧光信号在样中的相对位置，从而确定各标识所代表的成分位置。;;荧光与透射光共定位

虽然透射光不是共焦图像，但可以提供诸多有用的信息，可观测到样品细胞的数量，位置轮廓和某些形态学构造，这些透射光信息在荧光定位中很重要，当荧光为点片状分布时，只有荧光信息还不能定位，但假如与透射光叠加，则可看出荧光信号分布区域。;;定量测定

共焦显微镜将所采集的共焦图像中有关数据，转化为定量数据，即称之为定量测定：1图像中任意区域（或线）的荧光强度。2荧光强度伴随时间，空间及波长的变化曲线和数据。3图像内的几何参数，包括面积，厚度，空间距离，体积等。;定量测定

;;;动态监测

;特点：原位监测即持续采集样品上某一固区域内的荧光图像

扫描图像速度快，可实现对毫秒级变化或微米及移动的荧光信号进行实时监测

扫描方式多样。线扫描，平面扫描，持续断层扫描等方式跟踪样品荧光强度和分布随时间的变化

选用感爱好区域，只对该区域进行动态监测;某时间段内动态监测图象;;常见的应用和措施;用激光扫描共聚焦显微镜在细胞原位检测核酸

激光扫描共聚焦显微术通过成像显示出细胞内核酸的分布特性及含量，即实现定位，定性及定量检测核酸

常用：细胞核定位及形态学观测染色体观测等

前提：需将核酸用荧光探针标识

常用荧光探针：Hoechst33342Hoechst33258DAPI等

都是DNA特异性的荧光染料，细胞毒性小，特异性强，专一性地与DNA相结合，与DNA结合后都是以紫外光激发，发射明亮的蓝色荧光，辨别率高;免疫荧光标识技术;多标;检测荧光蛋白;图ch1-ch5为激光扫描共聚焦显微镜采集的四种荧光蛋白的分解图象。其中BFP(蓝色）位于内质网，GFP(绿色）位于细胞核中，YFP(黄色）位于胞膜，RFP(红色）位于线粒体。图ch5为四种荧光蛋白在细胞中的共定位。;检测细胞凋亡;共聚焦显微镜获取Annexin-v共焦图像的种类及试验成果分析;;检测细胞融合;观测细胞骨架;FITC-毒伞素结合的肾细胞内微丝;检测细胞内脂肪;实时定量测定细胞内钙离子的变化;;检测荧光漂白恢复

荧光漂白后的恢复技术（fluorescencerecoveryafterphotobleaching,FRAP