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用于鉴定具有独特核糖体翻译谱的哺乳动物细胞亚群的方

法

专利名称：用于鉴定具有独特核糖体翻译谱的哺乳动物细胞

亚群的方法

技术领域

本发明一般涉及具有独特核糖体谱，即翻译活性的哺乳动物

细胞亚群。本发明进一步涉及用于鉴定和分离这些细胞的方

法、包含这些细胞的试剂盒，或利用这些哺乳动物细胞亚群

的方法。

背景技术

生物体中的正常生物活性结合了构成个体基因组的基因响

应于外界的内源性表达。在高级真核生物中，基因表达开始

于细胞核中，其中基因组DNA转录为pre-mRNA或“初级”RNA

转录物。而仍在细胞核中，pre-mRNA被修饰为包括5帽结

构，形成异核核糖核蛋白(hnRNP)复合体，获得3多聚腺苷

酸尾，并经历剪接以去除间插RNA序列(例如内含子)。成

熟mRNA接着输出到细胞质，在那里蛋白质复合体指导(1)经

由5帽结构与核糖体的缔合，称为帽依赖性翻译，或⑵与促

进mRNA储存、加工或降解的胞浆RNA结合蛋白的相互作用。

在核糖体驱使的翻译之后，3-多聚腺苷酸尾的连续缩短导

致mRNA体转运至核糖核酸酶(RNAse)的复合体(称为外来体)，

其降解老化的mRNA并有效地终止蛋白质合成。如所预期的，

基因表达是必定在特定时间、以特定速率和数量产生所需基

因产物(通常是多肽)的高度调节过程。除转录调节之外，转

录后过程诸如mRNA衰变和翻译也是基因表达中的关键检查

点。不足为奇的是，由基因突变或对外部刺激的异常反应所

产生的细胞表达谱的改变会引起严重异常，该严重异常常常

导致急性细胞死亡或慢性疾病表型的表现。由环境因素(诸

如营养水平改变、细胞因子、激素和温度变动)以及环境应

激(如低氧、低钙血、病毒感染和组织损伤)所引起的广泛或

长时间的细胞刺激导致帽依赖性翻译的快速衰减。此过程是

自适应性的，因为它缩减了立即应激反应和恢复所不需要的

全蛋白质合成。然而，此翻译减弱并不完全消除核糖体活性，

因为应激反应和恢复基因的许多产物继续由称为非帽依赖

性翻译的替代过程来合成(评述于Guhaniyogiamp;Brewer，

2001，Gene265(1-2):11-23)。非帽依赖性翻译通过将核

糖体直接募集到称为内部核糖体进入位点(IRES)的特异性

RNA结构而发生。IRES元件已经在许多真核生物mRNA中得

到鉴定(BormalS等，(2003)NucleicAcidsRes.31:427-4

)，并确保在“帽依赖性”翻译起始受到抑制时(即，凋亡、

饥饿、Y辐射、低氧、有丝分裂或终末分化)在细胞核失活或

急性细胞应激期间蛋白质或其片段的高效表达。忽视对5

mRNA帽结构的需要最初被描述为不考虑感染细胞中细胞帽

依赖性翻译的几乎完全抑制而翻译病毒RNA的机制(Jang等，

1988，J.Virol.,62=2636-43)。一般来说，IRES序列无法

由序列同源性鉴定，并且使用功能性试验验证了充分表征的

IRES元件(Mountford禾口Smith,1995,TIG,11(5)

179-184;Baird等，2006，NAR,12(10):1755-85)。当前

证据显示，IRESRNA的构象和辅助蛋白与特异性mRNA序列

的结合使核糖体能够结合。在真核细胞中，IRES指导的翻

译常常与含有特别长的热力学稳定的RNA二级结构的mRNA

的5非翻译区(5UTR)相关联，所述二级结构具有多个短开

放阅读框(ORF)，其显著抑制核糖体依赖性翻译的起始。然

而，对于许多这些5‘UTRIRES元件的IRES活性的功能验

证因存在克隆自重叠5基因启动子的转录效应子序列而复

杂化。在IRES报告载体中采用这些5UTR元件的尝试因这

一剩余本底转录活性而复杂化，所述剩余本底转录活性掩盖

了由这些序列产生的任何翻译调节。因此，非帽依赖性翻译

和它的调节仍然是未研究的领域，大体上利用翻译作为读

出工具的系统也如此。发明概述本发明的一个目的在于提供

用于鉴定所需的哺乳动物细胞亚群的方法。所述方法包括用

至少一种毒素处理哺乳动物细胞亚组以形成毒素处理细胞，

哺乳动物细胞用包含以下任一项的核酸表达盒稳定转化(1)

编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的

TR元件，和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列，该序列

编码报告基因并从TR元件翻译；或