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用于鉴定具有独特核糖体翻译谱的哺乳动物细胞亚群的方
法
专利名称:用于鉴定具有独特核糖体翻译谱的哺乳动物细胞
亚群的方法
技术领域
本发明一般涉及具有独特核糖体谱,即翻译活性的哺乳动物
细胞亚群。本发明进一步涉及用于鉴定和分离这些细胞的方
法、包含这些细胞的试剂盒,或利用这些哺乳动物细胞亚群
的方法。
背景技术
生物体中的正常生物活性结合了构成个体基因组的基因响
应于外界的内源性表达。在高级真核生物中,基因表达开始
于细胞核中,其中基因组DNA转录为pre-mRNA或“初级”RNA
转录物。而仍在细胞核中,pre-mRNA被修饰为包括5帽结
构,形成异核核糖核蛋白(hnRNP)复合体,获得3多聚腺苷
酸尾,并经历剪接以去除间插RNA序列(例如内含子)。成
熟mRNA接着输出到细胞质,在那里蛋白质复合体指导(1)经
由5帽结构与核糖体的缔合,称为帽依赖性翻译,或⑵与促
进mRNA储存、加工或降解的胞浆RNA结合蛋白的相互作用。
在核糖体驱使的翻译之后,3-多聚腺苷酸尾的连续缩短导
致mRNA体转运至核糖核酸酶(RNAse)的复合体(称为外来体),
其降解老化的mRNA并有效地终止蛋白质合成。如所预期的,
基因表达是必定在特定时间、以特定速率和数量产生所需基
因产物(通常是多肽)的高度调节过程。除转录调节之外,转
录后过程诸如mRNA衰变和翻译也是基因表达中的关键检查
点。不足为奇的是,由基因突变或对外部刺激的异常反应所
产生的细胞表达谱的改变会引起严重异常,该严重异常常常
导致急性细胞死亡或慢性疾病表型的表现。由环境因素(诸
如营养水平改变、细胞因子、激素和温度变动)以及环境应
激(如低氧、低钙血、病毒感染和组织损伤)所引起的广泛或
长时间的细胞刺激导致帽依赖性翻译的快速衰减。此过程是
自适应性的,因为它缩减了立即应激反应和恢复所不需要的
全蛋白质合成。然而,此翻译减弱并不完全消除核糖体活性,
因为应激反应和恢复基因的许多产物继续由称为非帽依赖
性翻译的替代过程来合成(评述于Guhaniyogiamp;Brewer,
2001,Gene265(1-2):11-23)。非帽依赖性翻译通过将核
糖体直接募集到称为内部核糖体进入位点(IRES)的特异性
RNA结构而发生。IRES元件已经在许多真核生物mRNA中得
到鉴定(BormalS等,(2003)NucleicAcidsRes.31:427-4
),并确保在“帽依赖性”翻译起始受到抑制时(即,凋亡、
饥饿、Y辐射、低氧、有丝分裂或终末分化)在细胞核失活或
急性细胞应激期间蛋白质或其片段的高效表达。忽视对5
mRNA帽结构的需要最初被描述为不考虑感染细胞中细胞帽
依赖性翻译的几乎完全抑制而翻译病毒RNA的机制(Jang等,
1988,J.Virol.,62=2636-43)。一般来说,IRES序列无法
由序列同源性鉴定,并且使用功能性试验验证了充分表征的
IRES元件(Mountford禾口Smith,1995,TIG,11(5)
179-184;Baird等,2006,NAR,12(10):1755-85)。当前
证据显示,IRESRNA的构象和辅助蛋白与特异性mRNA序列
的结合使核糖体能够结合。在真核细胞中,IRES指导的翻
译常常与含有特别长的热力学稳定的RNA二级结构的mRNA
的5非翻译区(5UTR)相关联,所述二级结构具有多个短开
放阅读框(ORF),其显著抑制核糖体依赖性翻译的起始。然
而,对于许多这些5‘UTRIRES元件的IRES活性的功能验
证因存在克隆自重叠5基因启动子的转录效应子序列而复
杂化。在IRES报告载体中采用这些5UTR元件的尝试因这
一剩余本底转录活性而复杂化,所述剩余本底转录活性掩盖
了由这些序列产生的任何翻译调节。因此,非帽依赖性翻译
和它的调节仍然是未研究的领域,大体上利用翻译作为读
出工具的系统也如此。发明概述本发明的一个目的在于提供
用于鉴定所需的哺乳动物细胞亚群的方法。所述方法包括用
至少一种毒素处理哺乳动物细胞亚组以形成毒素处理细胞,
哺乳动物细胞用包含以下任一项的核酸表达盒稳定转化(1)
编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的
TR元件,和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列,该序列
编码报告基因并从TR元件翻译;或
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