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用于鉴定和分离表达多肽的细胞的方法

专利名称：用于鉴定和分离表达多肽的细胞的方法

技术领域：

本发明的领域总体上涉及新型多肽和包含所述多肽的细胞。

本发明还涉及在鉴定和/或分离表达多肽的细胞的方法中使

用所述多肽。所述方法可用于鉴定和分离产生抗原特异性单

克隆抗体的细胞。

背景技术：

自1970年代单克隆抗体技术发展以来，单克隆抗体已成为

日益重要的治疗剂种类。杂交瘤技术仍然是用于生成单克隆

抗体的最常用方法。单克隆抗体从通过将正常抗体生成B-

细胞与永生化骨髓瘤细胞或其它永生化细胞融合产生的杂

交瘤细胞分泌。单克隆抗体产生的过程通常包括几轮筛选上

清液以鉴定生成结合目标抗原的抗体的杂交瘤。生成针对目

标抗原的单克隆抗体的杂交瘤的鉴定通常通过ELISA筛选来

完成。可筛选由来自杂交瘤文库的随机杂交瘤克隆的混合物

生成的上清液。该方法具有局限性，因为其接着必须通过有

限稀释阳性混合物(positivepool)以分离单个克隆，随后所

有克隆需要进行再筛选。在一些情况下，通过作为生成非常

大量单一克隆的第一步骤进行有限稀释来克隆杂交瘤文库，

以进行筛选。包括有限稀释步骤的任何方法是有问题的，因

为其是极其费时费力的。此外，在一些情况下，期望的克隆

可代表杂交瘤文库的极低百分比，这使得稀少克隆的鉴定十

分困难。此外，ELISA筛选法鉴定对单个抗原的结合活性。

为了确定单克隆抗体是否结合超过一种抗原，必须利用不同

的个别抗原进行多个连续ELISA筛选。如果生成抗体的细胞

以允许抗体生成细胞本身被直接鉴定的形式(例如，在细胞

的表面上)保留抗体，则这是有利的。该策略是噬菌体展示

技术一直如此成功的原因之一。事实上，正常B-细胞产生

膜结合免疫球蛋白并且该分子是响应与抗原的结合发出信

号的B-细胞受体复合物的核心组分。天然膜结合抗体的存在

先前已被用于试图直接分离杂交瘤(参见，Parks等人1979，

PNAS，76:1962-1966)。然而，极低水平的膜结合抗体限制

了方法的使用。已开发了几个其它技术来进一步完成该目标。

一个方法是“分泌捕获报告网(secretioncapturereport

web)”(SCRW),其将细胞封装在生物素化的琼脂糖微滴中，

随后将微滴悬浮物与抗生物素蛋白和生物素化的抗-小鼠

IgG继续温育。抗生物素蛋白用作生物素化的琼脂糖与生物

素化的抗-小鼠抗体之间的桥梁以在微滴内形成捕获位点来

捕获由细胞分泌的抗体。可筛选此类含抗体的微滴结合报道

分子(例如，荧光标记的抗原)的能力并且可利用流式细胞术

分离所述微滴。(参见，Kenney等人，1995,

NatureBiotechnology8:787-90;Gray等人，1995,J.

Immunol.Methods182:155-63)。其它方法基于瞬时捕获分

泌的蛋白质或细胞表面上的抗体的能力。可通过报道分子(例

如，荧光标记抗原)的结合检测细胞表面上的“捕获的”蛋

白质或抗体并且例如通过流式细胞术(参见，例如，美国专

利No.6，919，183和7，166，423;美国专利申请No.

2010/0009866)进行分离。此类技术的每一个技术具有局限

性。琼脂糖微滴技术在技术上存在困难并且需要专门的设备

来产生琼脂糖微滴。此外，细胞可能对封装过程敏感。细胞

表面捕获法不能完全区分由目标杂交瘤细胞生成的抗体与

由其它杂交瘤细胞生成的抗体。相邻细胞之间的目标抗体或

蛋白质的扩散可以是个问题。例如，抗体可与与生成其的细

胞上的捕获分子分离并且扩散至生成不同抗体的细胞并且

被该细胞“捕获”。因此，在一些情况下，所述方法需要高

度粘稠的培养基来减少蛋白质或抗体从表达细胞的扩散。此

外，实际上，并非所有由杂交瘤生成的抗体都被捕获在细胞

表面上，该过量抗体被分泌入培养基中，在培养基中其容易

结合其它随机杂交瘤细胞上的捕获分子。因此，需要用于鉴

定和选择生成抗原特异性单克隆抗体的细胞的新型和/或改

进的方法。

发明概要本发明描述了新型多肽和包含所述多肽的细胞以

及使用所述多肽、细胞和细胞文库鉴定和/或分离生成所述

多肽的细胞的方法。具体地，所述方法可用于鉴定和分离生

成抗原特异性单克隆抗体的细胞。本发明提供了其中包含单

个抗原结合位点的膜结合的异二聚体分子在细胞表面上表

达的方法。单个抗原结合位点代表了由细胞生成的抗体的结

合特异性。异二聚体分子不“结合”分泌的抗体，因此，对

于由一个细胞生成的结合在或存在于另一