细胞工程植物种质保存.pptxVIP

二、种质保留意义

伴随经济发展，地球不停开发及生态环境破坏，每年都有多个物种消失或濒临灭绝。各种植物，包含栽培种、野生种甚至杂草，都含有各自独特优良基因，是植物品种改良乃至农业可连续发展基础。它们是经过长久进化而来，一旦失去不会再来。所以，世界各国都很重视植物种质资源搜集与保留研究。

;三、种质保留方法

按保留地理位置分为原地保留和异地保留。原地保留是在原来生态环境条件下,就地保留,自我繁殖品种资源,普通野生品种资源采取这种方式保留,如建立自然保护区,天然公园等；异地保留是将种子或植株保留于该品种资源原产地以外地域,这种保留可采取植物园、种质园、种质库等形式或采取试管保留形式。

按照保留详细方法,品种资源保留可分为种植保留、贮藏保留、试管保留、基因文库保留。

;;;;;3、基因文库保留

利用DNA重组技术，将种质材料总DNA或染色体全部片断随机连接到载体上，然后转移到寄主细胞中，经过细胞增殖，组成各个DNA片断克隆系。

;;第二节试管保留

一、常温下试管保留

可利用试管苗继代培养保留，但需要经常更换培养基。

;二、常温抑制生长保留

为了延缓继代时间，可在培养基中添加长抑制剂或提升渗透压等。如脱落酸(ABA)、矮壮素（2-氯乙基三甲基氯化按，简称CCC）、二甲氨基琥珀酸酰胺（简称B9）、多效唑（PP333）等都是生长抑制物质，培养基中添加一定量能够延缓生长。普通情况下几个月继代一次，而添加这些物质后，可到达一年甚至以上。

提升培养基渗透压也能够延缓生长。可用蔗糖或甘露醇，浓度分别调到10%左右和4%—6%。

;三、中低温调控生长保留

在试管苗继代培养过程，适当降低温度，也能延缓生长，延长继代时间。普通植物可调到1—9℃，热带、亚热带植物调至10—20℃。

;四、常温抑制生长保留与中低温调控生长保留相结合

培养基中添加生长抑制剂或提升渗透压，培养温度降低，使继代时间延长。

;第三节超低温保留Cryopreservation

一、超低温保留基本原理和主要步???

在液氮中（-196℃），几乎全部细胞代谢活动停顿，仅保留细胞活力和形态发生潜力。当解冻后，能够恢复再生能力。

超低温保留比较复杂，哪一步操作不妥，都会使细胞受伤害，失去再生能力。

注：超低温通常指低于一80℃低温，保留介质或容器有干冰(一79℃)、超低温冰箱(-80-150℃)、液氮(-196℃)和液氮蒸气相(-140℃)等，其中液氮最惯用。;;二、超低温保留技术

1、保留材料选择

2、冷冻前材料预处理

3、添加冷冻防护剂

4、材料冷冻方法（预冷）

5、材料保留

6、保留材料解冻

7、保留材料复苏培养

;1、保留材料选择

花粉、茎尖分生组织、芽、种胚、小植株、愈伤组织、体细胞胚等均能够作为保留材料。

;2、冷冻前材料预处理

为了使保留材料适应超低温条件，必须进行预处理。

预处理方法：将保留材料放在高糖浓度、添加二甲基亚砜（DMSO）、脯氨酸，在靠近零度下培养数日。

;3、添加冷冻防护剂

为了抵抗冻害，使用冷冻防护剂。惯用冷冻防护剂有：二甲基亚砜（DMSO）、甘油、脯氨酸、糖类、乙二醇、二甘醇、乙酰胺、福美氧化硫等。

;4、材料冷冻方法

材料冷冻保留原理：冷冻时，细胞外溶液水分子，先形成冰晶中心，而冰晶形成速度与溶液成份、降温速度相关。普通在-20℃—-60℃范围内，晶体中心增加最快，形成大块冰晶体之后，慢慢减速，到-140℃时完全停顿增加。

;4、冷冻处理

（1）快速冷冻

将植物材料从0℃或者其它预处理温度直接投入液氮中保留方法。降温速度为1000℃/min。植物体内水分在降温冷冻过程中，从-10℃—-140℃范围内是冰晶形成和增加危险温度区，到-140℃时完全停顿增加，关键是利用高速降温越过冰晶增加危险温度区，不能形成致死冰晶，细胞内水分固化，不会破坏细胞结构。

;（2）慢速冷冻法

将植物材料从0℃或者其它预处理温度以降温速度为1~2℃/min从起始温度降到-100℃，稳定1h后投入液氮中保留或以此降温速度降至-196℃。

在这种降温速度下，细胞内水分有充分时间不停渗透到细胞外结冰，使细胞内水分降低到最底程度，防止细胞内结冰;（3）预冷冻法

投入液氮前，需经过短暂时间低温锻炼方法

①两步冷冻：慢速冷冻至-40℃，停留一段时间，快速冷冻。

②逐层冷冻：材料经过不一样温度等级降温至-40℃，停留一段时间，投入液氮快速冷冻。

;（4）干燥冷冻

将材料置于27~29℃烘箱内降低植物含水量，