层析分离纯化技术策略课件.pptVIP

蛋白层析分离纯化技术1

·分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括·1.分子的大小和形状·2.酸碱性质·3.溶解度·4.吸附性质·5.对配体分子的特异生物学亲和力。2

常用测定方法：·1.根据化学组成测定最低相对分子质量·2.凝胶过滤法测定相对分子质量·3.聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量·4.渗透压法·5.沉降分析法（离心）3

沉淀蛋白质的方法·(1)盐析法·(2)有机溶剂沉淀法·(3)重金属盐沉淀法·(4)加热变性沉淀法4

蛋白质纯化策略简单纯化一步亲和层析90-97%纯度融合蛋白质更高纯度多步纯化粗提中度纯化精细纯化表达三步纯化策略非融合蛋白质5

高效纯化策略精细纯化分辩率纯化速度粗提载量回收率6

减少处理步骤得率(%)1008060402095%/步90%/步85%/步80%/步75%/步012345678步骤7

准备工作考虑:蛋白质特性:·纯度水平·需要量·稳定性-pH-离子强度·保持生物活性·有效和经济-温度·分子量·等电点8

pH的重要性:蛋白质净电荷随pH改变滴定曲线不同pH下的分离情况3pH10+1稳定性范围用阳离子交换用阴离子交换2-129

pH的重要性:蛋白质净电荷随pH改变流动相的pH选择性AbsAbsVAbsVAbsVV+0-阳离子pH表净荷阴离子AbsAbsVAbsAbsVVV10

样品准备考虑:·根据蛋白质来源选择不同萃取方法·使用温和的步骤减少酸化和释放蛋白酶·在室温以下快速处理·用缓冲液维持pH,离子强度目的:稳定样品11

三步纯化策略精细纯化达到最高纯度中度纯化去除大部分杂质粗提分离,浓缩和稳定样品样品准备,萃取,净化Step12

三步纯化策略层析填料的颗粒大小精细纯化中度纯化粗提步骤13

三步纯化策略流速精细纯化中度纯化粗提步骤14

三步纯化策略分辩率精细纯化中度纯化粗提步骤15

前处理·分离纯化某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。·动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织，·种子材料应先去壳甚至去种皮以免受杂质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。·然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。16

样品预处理污染物害处预防措施膜过滤、离心、匀浆絮状物堵柱离心、如可跟目标分子兼容，可用有机溶剂阻断配基、引致凝集、非特异吸附脂类添加硫酸链霉素、硫酸精蛋白或锰盐沉淀核酸、添加核酸酶核酸阻断配基、高黏度添加蛋白酶抑制剂、用亲和层析去除蛋白酶、缩短粗分时间、低温操作蛋白酶分解目标分子17

粗提目的·纯化粗样·快速浓缩(减少体积)和稳定样品(去除蛋白酶)最适用层析技术:离子交换/疏水层析分辩率快速载量回收率18

粗提:离子交换填料预装柱20ml颗粒大小90μm流速HiPrep?16/10QXLSPXLHiPrep16/10DEAECM10ml/min10ml/min90μmSepharose?FastFlowSepharose?BigBeadsSTREAMLINE?19

粗提:疏水层析填料·高载量·高流速HiPrep?16/10Phenyl(高低取代)HiPrep16/10ButylHiPrep16/10OctylHiTrap?HIC选择试剂盒20

中度纯化目的·去除大部分杂质最适用层析技术:离子交换/疏水层析分辩率快速载量HiLoad?离子交换和疏水层析预装柱回收率21

中度纯化:离子交换填料SOURCE?30μmSepharose?HP34μm交联琼脂醣QSP聚苯乙烯/二乙烯基苯QS150cm/hr小包装和预装柱1800cm/hr小包装SepharoseHighPerformanceSOURCE3022

中度纯化:疏水层析填料Sepharose?HP34μm苯基小包装和预装柱300cm/hr23

精细纯化目的·达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物)最适用层析技术:凝胶过滤/离子交换/疏水层析/反相层析分辩率速度载量回收率24

精细纯化:凝胶过滤填料Superdex?PeptideM100-7000rSuperdex75M3000-70000rSuperdex200M10000-600000r1021031041051分离分子量大小(球状蛋白质)HR预装柱(13μm)用prepgrade(34μm)放大25

精细纯化:离子交换填料Mono?Bead