01-实验一-总糖和还原糖的测定(3-5-二硝基水杨酸法)(4).ppt

生物化学实验

（生物工程、生物信息、张之洞班）生物化学技术

（生物技术、应用生物技术、生物科学）实验内容（40学时）

（生物工程、生物信息、张之洞班）还原糖的测定（4）蛋白质N端分析（4）酶的底物专一性（4）植物DNA的提取（4）DNA的酶切和电泳（4）（操作考试）酵母醇脱氢酶的提取和纯化（12）SDS测定蛋白质分子量（8）实验内容（60学时）

（生物技术、应用生物技术、生物科学）还原糖的测定（4）蛋白质N端分析（4）酶的底物专一性（4）植物DNA的提取（4）DNA的酶切和电泳（4）（操作考试）酵母醇脱氢酶的提取和纯化（12）亲和层析分离纯化蛋白质（14）WesternBlot鉴定目的蛋白（14）实验要求按时上课，不得缺席预习实验内容认真观察实验现象，如实记录实验数据独立分析实验结果，按时完成实验报告实验室守则保持室内安静、整洁严格按操作规程使用仪器设备，节约试剂和实验材料实验过程中注意水、电、门窗安全实验完毕后，将仪器、器皿放归原处做好实验室卫生特别注意若发生仪器故障其它事故，应立即切断相关电源，及时报告老师违反操作规程造成事故、仪器损坏，将按学校有关规定赔偿实验报告每人1份，下次实验课前交。实验一还原糖的测定（3,5-二硝基水杨酸法）掌握还原糖的测定原理学习还原糖的3,5-二硝基水杨酸(DNS)测定法。目的单糖和某些寡糖含有游离的醛基或酮基，有还原性，属于还原糖；而多糖和蔗糖等属于非还原性糖。原理还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其他产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物在540nm处有最大吸收，在一定的浓度范围内还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中还原糖的含量。黄色棕红色1、红薯2、试管1.5cm×15cm(×10)、试管1.8cm×18cm(×2)3、吸管1mL(×2)、10mL(×2)4、水浴锅。5、电炉。6、722型分光光度计7、pH试纸（1~14）8、容量瓶100mL(×3)。9、量筒、研钵、三角烧瓶、玻璃漏斗。10、电子天平1、标准葡萄糖溶液（2.0mg/mL）：准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg，溶于蒸馏水并定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。2、3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：将6.3gDNS和262mL2mol/LNaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，存储于棕色瓶中备用。操作1、葡萄糖标准曲线的制作：取干净试管6支，按下表进行操作。以吸光度作为纵坐标，各标准液浓度（mg/mL）作为横坐标，作图得标准曲线。（比色皿中装2/3液体即可）管号试剂012345标准葡萄糖溶液/mL00.10.20.30.40.5蒸馏水/mL1.00.90.80.70.60.5DNS试剂/mL2.02.02.02.02.02.0沸水浴中准确煮沸5min，取出，用自来水冷却至室温蒸馏水/mL7.07.07.07.07.07.0葡萄糖浓度/mg/mL00.20.40..60.81.0A540nm用EXCEL作图、求R2和公式2、样品中还原糖提取：准确称取0.5g红薯，加蒸馏水约2mL，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用15mL的蒸馏水冲洗研钵，洗出液也转入三角烧瓶中。将三角烧瓶于50℃水浴中保温0.5h，不时搅拌，使还原糖浸出。将浸出液（含沉淀）转移到50mL离心管中，于4000r/min下离心5min，沉淀用20mL蒸馏水洗一次，再离心，将两次离心的上清液合并，用蒸馏水定容至100mL，混匀，作为还原糖待测液。取1mL进行还原糖的测定。操作离心机使用时一定要等重配平（离心管+盖子+内容物）=（离心管+盖子+内容物）精确到小数点后2位空白还原糖溶液待测溶液/mL01.01.0蒸馏水/mL1.000DNS试剂/mL2.02.02.0沸水浴中准确煮沸5min，取出，用自来水冷却至室温蒸馏水/mL7.07.07.0葡萄糖浓度/