T_CVMA 160-2024 猪链球菌与副猪格拉菌双重TaqMan实时荧光PCR检测方法.docxVIP

ICS11.220CCSB41

团体标准T/CVMA160—2024

猪链球菌与副猪格拉菌双重TaqMan实时荧光PCR检测方法

DetectionmethodofduplextheTaqManreal-timePCRassayforStreptococcussuisandGlaesserellaparasuis

2024-5-8发布2024-5-8实施

中国兽医协会发布

T/CVMA160—2024

I

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国兽医药品监察所提出。

本文件由中国兽医协会归口。

本文件起草单位：中国兽医药品监察所。

本文件主要起草人：刘燕、朱良全、王豪杰、胡云皓、辛凌翔、刘元杰、姚文生、李建、王秀丽、王琦。

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猪链球菌与副猪格拉菌双重TaqMan实时荧光PCR检测方法

1范围

本文件规定了猪链球菌与副猪格拉菌双重TaqMan实时荧光PCR检测方法的试剂材料、仪器设备、样品的采集与处理、操作方法和结果判定等。

本文件适用于检测猪链球菌和副猪格拉菌的核酸。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

实时荧光PCR：实时荧光聚合酶链式反应（Real-timepolymerasechainreaction）

Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数（Cyclethreshold）

DNA：脱氧核糖核苷酸（Deoxyribonucleicacid）FAM：6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein）

TAMRA：6-羧基四甲基若丹明（Carboxytetramethylrhodamine）BHQ：无荧光淬灭基团（Blackholequencher）

DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate）ddH2O：双蒸水（Distillation-DistillationH2O）gdh：谷氨酸脱氢酶（glucosedehydrogenase）

infB：翻译起始因子（translationinitiationfactorIF2-IF2alphaandIF2beta）

5试剂和耗材

T/CVMA160—2024

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5.1试剂

5.1.1除非另有说明，所有试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T6682的要求。

5.1.2细菌总核酸提取试剂或其他等效核酸提取试剂。

5.1.3消化液I按照附录C1配制。

5.1.4消化液II按照附录C.2配制。

5.1.5酚/氯仿/异戊醇混合液按照附录C.3配制。

5.1.6TEBuffer（pH8.0）按照附录C.4配制。

5.1.7PBS缓冲液按照附录C.5配制。

5.1.8异丙醇和75%乙醇。

5.1.9PCR试剂及DNA凝胶回收试剂盒。

5.1.10多重荧光定量PCR试剂。

5.2阳性对照

含有猪链球菌通用型gdh基因片段（参考序列见附录A.1）、副猪格拉菌infB基因片段（参考序列见附录A.2）的重组质粒按照附录A.3制备。

5.3阴性对照

灭菌生理盐水，按照附录A.4制备。5.4引物和探针序列

引物和探针序列见附录B。

6仪器设备

荧光定量PCR检测仪、高速冷冻离心机、振荡器、紫外分光光度计、微量移液器（量程：10μL、20μL、200μL和1000μL）、冰箱（2℃~8℃和?20℃以下）、组织匀浆器、混匀器。

7样品的采集和处理

样品采集和处理应符合NY/T541-2016的要求。所采集的样品包括猪鼻/口拭子、疑似阳性猪组织病料样品（关节液、扁桃体、肺脏等）及养殖场环