NYT 553-2015 禽支原体PCR检测方法.docxVIP

ICS11.220B41

N

中华人民共和国农业行业标准

NY/T553—2015

代替NY/T553—2002

禽支原体PCR检测方法

Detectionofavianmycoplasmas

bypolymerasechainreaction(PCR)

2015-05-21发布2015-08-01实施

中华人民共和国农业部

发布

I

NY/T553—2015

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准代替NY/T553—2002《禽支原体病诊断技术》。

本标准与NY/T553—2002相比，删除了血清凝集实验，选取了PCR方法检测鸡毒支原体和滑液囊支原体。

本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。

本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心。

本标准主要起草人：王娟、李卫华、王玉东、黄秀梅、龚振华、郭福生。本标准的历次版本发布情况为：

NY/T553—2002。

NY/T553—2015

禽支原体PCR检测方法

1范围

本标准规定了禽支原体PCR(聚合酶链式反应)的检测技术要求。本标准适用于禽支原体病的流行病学调查和辅助性诊断。

2缩略语

下列缩略语适用于本文件。

MG:mycoplasmagallisepticum鸡毒支原体。MS:mycoplasmasynoviae滑液囊支原体。

PBS:phosphatebufferedsolution磷酸盐缓冲液。

3实验室设备要求

3.1仪器

基因序列分析仪、台式高速冷冻离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外凝胶成像系统、微量移液器、水浴锅、涡旋仪等。

3.2操作区域

样品处理区要有相应的生物安全设施；配液区要求高度洁净；电泳区要与其他操作区域相互隔离。

3.3操作者

操作者应接受过PCR技术培训，熟悉防止核酸污染和溴乙锭污染的具体措施，熟悉电泳结果的判断方法。

4相关试剂

4.12×TagMasterMix

生物试剂公司生产。

4.21.5%琼脂糖凝胶

见A.1。

4.31×TAE缓冲液

见A.2。

4.4溴乙锭(10μg/μL)

见A.3。

4.5商品化的DNA分子量标准

要求在100bp～300bp之间有5条以上的指示条带。

4.6标准菌株

S6株、WVU1853株购自中国兽医药品监察所。

4.7阴性对照品

用高压灭菌的PBS作为阴性对照标准品。

5操作程序

5.1样品处理

2

NY/T553—2015

将气管拭子、关节囊穿刺液、关节面拭子样品悬浮于1mLPBS溶液中，混匀成悬浮液；气管、肺、气囊等组织器官充分研磨后，加入适量的PBS溶液，制成混悬液，备用；也可用分离培养后的菌液作为样品。

5.2DNA提取

将制成的悬浮液或悬液2000r/min离心5min,将离心后的上清或分离培养后的菌液置于1.5mL带盖的微量离心管中，在4℃条件下，14000g离心30min。用微量加样器仔细除去上清液，并将沉淀悬浮于25μL双蒸水中。将置于离心管中的内容物隔水煮沸10min,然后冰浴10min,14000g离心10min,上清液为DNA模板，用于扩增其16SrDNA。

5.3引物

5.3.1MG引物序列

MG-14F:5-GAGCTAATCTGTAAAGTTGGTC-3;MG-13R:5-GCTTCCTTGCGGTTAGCAAC-3。

5.3.2MS引物序列

MS-F:5-GAGAAGCAAAATAGTGATATCA-3;MS-R:5-CAGTCGTCTCCGAAGTTAACAA-3。

5.4PCR反应体系

25μLPCR反应体系包括：

ddH?O9.5μL

DNA模板2.0μL

2×TaqMasterMix12.5μL

上、下游引物混合物1.0μL每次试验应设阳性对照和阴性对照。

先94℃变性5min,然后按94℃变性30s、55℃退火3