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聚合酶链式反应（PCR）
聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片
段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）
引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目
的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）
使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两
侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA
聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→
3’方向延伸，合成DNA的新互补链。
PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起
始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR
技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、
克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多
态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR
在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：
(1)生成双链DNA中的特异序列作为探针；
(2)由少量mRNA生成cDNA文库；
(3)从cDNA中克隆某些基因；
(4)生成大量DNA以进行序列测定；
(5)突变的分析；
(6)染色体步移；
(7)RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。
一、试剂准备
1.DNA模版
2．对应目的基因的特异引物
3．10×PCRBuffer
4．2mMdNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCRbuffer5μl
dNTPmix（2mM）4μl
引物1（10pM）μl2
引物2（10pM）2μl
Taq酶（2U/μl）1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）1μl
加ddH2O至μl50
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃
预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃40s→58℃30s→72℃60s，循环30-35
次，最后在72℃保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行抽提反应混合液，以
除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
三、PCR反应体系的组成与反应条件的优化
PCR反应体系由反应缓冲液（10×PCRBuffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、
耐热DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）
五部分组成。各个组份都能影响PCR结果的好坏。
1．反应缓冲液：一般随TaqDNA聚合酶供应。标准缓冲液含：50mMKCl，10mMTris-HCl
（pH8.3室温），1.5mMMgCl2。Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。浓
度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为200μM时，
Mg2+为1.5mM较合适。若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+
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