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PCR技术发展与应用的研究进展

王亚纯

摘要：聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR是最常用的分子生物学

技术之一，通过变性、退火和延伸的循环来完成核酸分子的大量扩增．定量PCR

技术是克服了原有的PCR技术存在的不足，能准确敏感地测定模板浓度及检测基

因变异等，快速PCR技术快速PCR在保证PCR反应特异性、灵敏性和保真度的

前提下，在更短时间内完成对核酸分子的扩增．mRNA差异显示PCR技术是在基

因转录水平上研究差异表达和性状差异的有效方法之一．近年来已经开展了许多这

三方面的研究工作，本文就定量PCR技术、快速PCR技术、mRNA差异显示

PCR技术作一综述，以便更好地理解及应用这项技术。

关键字：定量PCR；荧光PCR；快速PCR；DNA聚合酶；mRNA差异显示

PCR

0前言

聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR技术由于PCR简便易行、灵敏

度高等优点，该技术被广泛应用于基础研究。但是，由于传统的PCR技术不能准

确定量，且操作过程中易污染而使得假阳性率高等缺点，使其在临床上的应用受到

限制[1]。鉴于此，对PCR产物进行准确定量便成为迫切的需要。几经探索，先后

出现了多种定量PCR(quantitativePCR，Q-PCR方法，其中结果较为可靠的是竞

争性PCR和荧光定量PCR(fluorescencequantitativePCR，FQ-PCR。

随着生命科学和医学检测的不断发展，人们越来越希望在保证PCR反应特异

性、灵敏性、保真度的同时，能够尽量缩短反应的时间，即实现快速PCR(Rapid

PCRorFastPCR。快速PCR技术不仅可使样品在有限的时间内可以尽快得到扩

增，而且可以显著增加可检测的样品数量，显然，在大批量样本检测和传染病快速

诊断等方面将会有重要的应用前景。例如，快速PCR在临床检测中可大大加快疾

病的诊断效率；在生物恐怖袭击时能有效帮助快速鉴定可疑物中有害生物的存在与

否；同时，由于PCR已经渗入到现代生物学研究的各个方面，快速PCR的实现必

然可以使许多科学研究工作的进展显著加快，最终影响到整个生物学发展的速度。

近年来，快速PCR技术得到了可喜的进展。从聚合酶的改进、添加剂的开发以及

热循环仪的革新创造三个不同途径上分别进行的研发表明。

生物的性状和生物对各种生物、理化及致病因子的应答，本质上都是基因在时

间上或空间上选择性表达，即基因的差异表达的结果，因而，获取差异表达的基因

信息，将有助于了解生物的生理变化和病理改变的分子机制[2]。研究基因差异表

达主要技术有：消减文库筛选、差异杂交、代表性差异分析、基因表达序列分析、

电子消减技术[3]和mRNA差异显示PCR技术等(mRNADifferentialDisplayPCR，

简称DD-PCR[4]。迄今为止，上面的几种方法已成功地用于基因差异表达的研

究。尤其是mRNA差异显示PCR技术，虽然发明只有短短十几年，已经取得了令

人瞩目的科研成果，原因是它具备需要总RNA的量极少，不需要纯化的

mRNA，操作简便、快速、灵敏等优点[5-8]，故已被许多生命科学实验室作为一

种重要工具，应用于体内和体外差异表达基因的筛选，研究基因功能[9]。现将定

量PCR技术、快速PCR技术、mRNA差异显示PCR技术研究情况作一综述作简

要综述。

1定量PCR技术

定量PCR（PolymeraseChainReaction）技术有广义概念和狭义概念。广义概

念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR

过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。狭义概念的定量PCR技术（严格意义

的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程

（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性

结果(扩增效率为零。广义概念下的定量PCR技术可以分为五种类型：

（1）外参法+终产物分析，是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。这

种类型没有对样本进行质控监测，易出现假阴假阳结果，没有监测扩增效率，定量

不准。

（2）内参法+终产物分析，是指样本与阳性参照在一个反应容器内反应