大二上生化试验精简.pptx

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2三、实验步骤及原理1、蔗糖酶的提取2、蔗糖酶的纯化3、各纯化级别蔗糖酶的活性测定4、各纯化级别蔗糖酶的蛋白质含量测定5、正交试验法测定不同条件对蔗糖酶活性的影响6、蔗糖酶酶促反应动力学研究7、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量

3生物材料破碎的方法（1）机械（匀浆）法（2）超声波处理法（3）反复冻融法（4）化学处理法（5）溶胞作用(酶溶解法)（6）自溶法

41.酶的蛋白属性；2.调节酶溶解度的方法；有机溶剂分级沉淀3.根据酶分子大小、形状不同的分离方法；透析、凝胶层析4.根据酶分子电荷性质的分离方法；离子交换层析5.根据酶分子专一性结合的方法;酶的纯化方法

51.酶的蛋白属性两性电离蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。等电点(isoelectricpoint,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。胶体分子量自1万至100万范围，分子直径可达1～100nm，为胶体范围之内。稳定的因素：颗粒表面电荷水化层2.调节酶溶解度的方法；（1）改变离子强度；盐溶/盐析硫酸铵分级沉淀（2）改变pH或温度；（3）改变介电常数；有机溶剂分级沉淀（本实验）：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。亲水性有机溶剂加入溶液后降低介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。亲水性有机溶剂的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了表面水化层的厚度，降低其亲水性，导致脱水凝集。

6有机溶剂分级沉淀操作条件的控制溶剂选择常用的溶剂是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜（DMSO）也可做沉淀剂。沉淀用有机溶剂的选择主要应考虑沉淀作用强、对生物分子的变性作用小、毒性小以及挥发性适中。温度使用有机溶剂沉淀生物大分子时应控制在低温下进行。样品浓度的控制一般认为蛋白质的初始浓度为0.5%-2%为好。3.根据酶分子大小、形状不同的分离方法；（1）离心分离；最为常用分布在细胞器匀浆后离心（2）透析、超滤；（3）凝胶层析（gelchromatography）凝胶层析的定义：凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析凝胶层析常见名称：凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析。

7凝胶层析的基本原理凝胶层析是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，其原理是分子筛效应，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。凝胶层析的应用范围：凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。凝胶层析的特点凝胶层析操作简便，所需设备简单；分离效果较好，重复性高。最突出的是样品回收率高，接近100％；分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及化学键的变化，所以对分离物的活性没有不良影响；应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。分离的分子量范围很宽，如SephadexG类为102～105D；Sepharose类为105～108D。

8装柱：将玻璃柱固定垂直，装入蒸馏水（约为柱体积的1/3），以避免胶粒直接冲击柱底支持物。固定玻璃柱，调整垂直；装凝胶：边搅拌凝胶，边向柱内缓慢、连续、均匀地装入凝胶（打开柱底端的螺旋夹）不要中断，使胶粒均匀沉降，以免胶面倾斜和发生断层；Sephadex-G100凝胶层析（本实验）检查：用眼观察有无凝胶分层、沟流和气泡现象；柱平衡：用脱气蒸馏水平衡凝胶柱，用出口处的螺旋夹将流速控制在1ml/min（用量筒和秒表测定）上样：将柱中的蒸馏水逐渐放出，当液面接近柱床表面时，用长滴管沿柱壁绕环小心加入E3，上样量控制在柱体积的2%-5%（不要冲坏柱床表面）；打开凝胶柱出口处的阀门，使样